Bu, Drosophila bağırsak asitleşmesini sağlam ve otantik sonuçlarla izlemek için en hızlı ve doğru protokoldür. Bu yöntem, bağırsak asitleşmesinin birden fazla organizmadaki rolünü belirlemeye yardımcı olacaktır. Ve bu fenomen bu tekniğin basitliği ana avantajdır.
Bu nedenle, model olmayan organizmalar için kullanılabilir. Bu yöntem, hücre hatları ve canlı kültürler üzerinde 3D dahil olmak üzere birçok sistem için asit salınımını izleyebilir. Bu teknik minimum çaba ile basittir.
Bromophenol mavisi içeren yiyecekler taze hazırlanmalıdır. Ek olarak, diseksiyon bağırsağı gerilmemelidir. pH algılama Bromophenol mavisi veya BPB boyası ile sinek gıdasının hazırlanması ile bağırsak asitleştirme izleme tahlilini düzenlemeye başlayın.
Bunu yapmak için, sinek yiyeceklerini bir mikrodalga fırında eritin ve ılık olana kadar soğumaya bırakın. Bir mililitre 4% BPB ılık yiyeceğe bir mililitreyi bir karıştırma kuyusu ile ekleyin. Bir pipet kullanarak, BPB içeren sinek yiyeceğini bir petri kabının ortasında yaklaşık 200 mikrolitrelik tek bir noktaya ekleyin.
Daha sonra, sıfır ila iki günlük bakire olmayan dişi Drosophila melanogaster sineklerini toplayın ve sineklerin standart mısır unu yiyeceklerinde iyileşmesine izin verin. Deneyden önce, sinekleri oda sıcaklığında yaklaşık iki mililitre deiyonize su ile ıslatılmış bir laboratuvar mendil dokusu içeren bir şişede 24 saat aç bırakın. Aç sinekleri, ışığa maruz kalırken oda sıcaklığında dört saat boyunca yemlemelerine izin vermek için% 2 BPB ile desteklenmiş taze hazırlanmış sinek yiyeceklerinin tek noktalarını içeren bir petri kabına aktarın.
Dört saat sonra sinekleri toplayın, ardından anestezi edilmiş sineklerin bağırsaklarını stereo mikroskop altında toparlama ile 1X PBS'de cerrahi olarak izole etmeye devam edin. Bağırsakta duran sağlam BPB'yi gösteren sineklerin sayısını sayın ve denklemi kullanarak yüzdeyi hesaplayın. Diseksiyondan sonra, PBS'deki örnekleri cam bir kaydırağa monte edin ve hazırlanan slaydı mikroskop altına yerleştirin.
Ardından IPS'yi kullanarak odağı ayarlayın. Tamamlandığında, kameranın deklanşörini açmak için IPS'yi kapatın. Bağırsak diseksiyonunun ardından, bazı Drosophila melanogaster dişi sineklerinin bağırsak CCR'sunda sarı renkte belirtildiği gibi asit ürettiği bulunmuştur.
Oysa bazı sineklerin bağırsakları maviydi, bu da sineklerin bağırsaklarını asitleştirmede başarısız olduğunu gösteriyordu. 30 dakika içinde sineklerin yaklaşık %20'si bağırsağı asitleştirmişti. Bir saat sonra, bağırsakların% 40'ı asitlenme gösterirken, iki ila üç saatlik beslenmeden sonra, asitlenmiş bağırsakların yüzdesi% 60 ila% 70'e yükseldi Sinekler dört saat boyunca beslendiğinde bağırsakların neredeyse% 90 ila% 95'i asitlendi.
İki farklı sıcaklık koşulunda bağırsak asitlenmesinde bir fark gözlenmedi. Bağırsak asitleştirme protokolünün etkinliği çeşitli Drosophila türlerinde değerlendirildi. Test edilen tüm türler sağlam bağırsak asitlenmesi gösterdi ve protokolün diğer organizmalara da uygulanabileceğini düşündürdü.
Hatırlanması gereken en önemli şey, yıldız sineklerini dört saat boyunca maya ve Bromophenol mavisi ile petri tabağına yerleştirmektir. Bu teknik, bağırsak asitlenmesinde yer alan temel biyolojiyi ve hücresel yolu anlamaya yardımcı olacaktır. Ayrıca bağırsak asitleşmesi ile ilgili hastalıkları oluşturmak için ilaç hedefini belirlemeye yardımcı olmalıdır.
