El ensayo de quiralidad de células bast de micropatrones es una herramienta poderosa para estudiar la morfogénesis quiral multicelular en el desarrollo de la enfermedad. También es importante para la investigación celular. Este sistema de macropatrones es fácil de fabricar y usar, es capaz de producir resultados altamente confiables y repetibles, y también es compatible con el procesamiento automatizado de alto rendimiento para un gran tamaño de muestra.
Comience cortando la corredera recubierta de titanio con oro en pequeñas piezas cuadradas de aproximadamente 12 por 12 milímetros. Con un cortador de vidrio, deslícese a través de la superficie para dejar una pista abollada, luego sostenga la diapositiva de vidrio a ambos lados y doble en la abolladura para romperse en cuartos pequeños. Para limpiar el portaobjetos, sumérjalo con el lado dorado hacia arriba en etanol 100% contenido en una placa de Petri en un agitador orbital durante al menos 10 minutos.
Después de aspirar el etanol, seque el portaobjetos soplando con una corriente de nitrógeno. Limpie los sellos de polidimetilsiloxano o PDMS con agua jabonosa antes de secar el sello con gas nitrógeno. Disuelva 5,74 miligramos de octadecanetiol o C18 en 10 mililitros de etanol al 100% para hacer dos solución milimolar C18, luego limpie los sellos PDMS con etanol 100%.
Remoje el sello PDMS con la superficie del patrón hacia abajo en solución C18 durante 10 segundos y luego séquelo suavemente con gas nitrógeno durante 60 segundos. Una vez seco, coloque el sello boca abajo en la diapositiva de oro durante 60 segundos antes de retirarlo. Para garantizar un estampado adecuado, toque suavemente las pinzas en el sello para transferir correctamente los patrones.
A continuación, prepare las cámaras de humedad pipeteando un mililitro de etanol al 70% en una tapa de placa de Petri invertida. Y usando las pinzas, coloque un trozo de parafilm para cubrir la superficie asegurándose de que no queden burbujas. Retire el exceso de etanol si es necesario.
Agregue 40 gotas de microlitros de solución EG3 por cada cuarto de portaobjetos de vidrio en la parapelícula en la cámara de humedad, dejando suficiente espacio entre las gotas para tener en cuenta el espaciado de las diapositivas de oro. Use pinzas para colocar la diapositiva de oro impresa C18 mirando hacia abajo sobre la gota, asegurándose de que no queden burbujas debajo de la diapositiva. Empuje suavemente las diapositivas juntas sin levantarlas para minimizar la evaporación.
Después de sellar la placa de Petri herméticamente con parafilm, déjela a temperatura ambiente durante al menos tres horas. En un gabinete de bioseguridad, remoje y enjuague el portaobjetos de oro hacia arriba tres veces en etanol al 70% para eliminar EG3, luego deje en etanol durante 10 minutos para la esterilización. Después de aspirar el etanol, agregue PBS estéril.
Prepare otra cámara de humedad con PBS en lugar de etanol como se ha demostrado. A continuación, agregue 50 gotas de microlitros de solución de fibronectina por cada cuarto de deslizamiento sobre la parapelícula, dejando algo de espacio entre las gotas. Luego coloque la diapositiva hacia abajo sobre la gota como se demostró anteriormente y deje la placa de Petri en el gabinete de bioseguridad durante 30 minutos.
Después de enjuagar la diapositiva recubierta de oro tres veces, coloque la diapositiva hacia arriba en PBS. Antes de sembrar las células, caliente los medios y la tripsina en un baño de agua templado a 37 grados centígrados. Para una mejor unión celular, remoje el portaobjetos del patrón en una placa de 12 pocillos que contenga medios de cultivo y caliéntelo a 37 grados centígrados en la incubadora.
Una vez que las células están tripsinizadas, neutralice las células con medios que contengan FBS, pegue las células a 100 veces G durante tres minutos y luego vuelva a suspender la bolita celular en medios frescos. Cuente las células y diluya la suspensión celular para lograr la concentración de 200, 000 células por mililitro. Agregue 0.5 mililitros de la suspensión celular a cada pozo que contenga una diapositiva de oro.
Agite suavemente la placa varias veces para una siembra celular uniforme antes de incubar durante 15 minutos para la fijación de la célula. Después de 15 minutos, verifique la unión celular bajo un microscopio y, si es necesario, incube durante más tiempo. Una vez que las células estén unidas, aspire los medios que contienen células no unidas de cada pozo y agregue un mililitro de medios de cultivo frescos.
Cultive las células en la incubadora durante 24 horas y verifique la confluencia para determinar si se ha formado quiralidad. Cuando se logre la confluencia requerida, fije las células eliminando los medios de cultivo. Después de enjuagar con PBS una vez, agregue una solución de paraformaldehído al 4% al portaobjetos e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos antes de enjuagar nuevamente con PBS tres veces.
Para adquirir las imágenes, utilice un microscopio de contraste de fase con funcionalidad de cámara y capture cada anillo en la diapositiva a alta resolución. Para la caracterización de quiralidad, descargue los archivos de código de MATLAB, agregue la carpeta de código y las subcarpetas a la ruta de acceso de MATLAB y abra el ROI_selection. m archivo.
En la línea cuatro, cambie el directorio a la carpeta de datos deseada. Cambie el tamaño de la imagen en la línea 14 con las dos primeras figuras que representan el tamaño del círculo interior del anillo, mientras que las otras dos representan el exterior. Para determinar la región de interés o el ROI en las imágenes de contraste de fase, ejecute el código de MATLAB ROI_selection.
m haciendo clic en el botón Ejecutar. Arrastre manualmente el cuadrado de selección para que se ajuste al anillo, luego haga doble clic en la imagen para confirmar la selección. Después de seleccionar el ROI de todas las imágenes de la carpeta, se generará un archivo mat para almacenar la información del ROI de cada imagen.
A continuación, abra el analysis_batch. m y cambie el directorio de la carpeta como se demostró anteriormente. Haga clic en el botón ejecutar para ejecutar el código analysis_batch.
m para determinar la quiralidad de múltiples patrones de anillos celulares. Un datatoexcel. Se generará un archivo txt que contiene estadísticas circulares para cada anillo, así como los números de anillos no quirales y antihorarios en el sentido de las agujas del reloj.
Los hallazgos actuales demuestran la utilidad del ensayo de quiralidad de patrón de anillo desarrollado experimentalmente, así como la sensibilidad de este ensayo a las alteraciones en el citoesqueleto. En el presente estudio, se encontró que al interrumpir la polimerización de actina con 50 tratamientos de latrunculina A nanomolar, las células de mioblasto C2C12 de ratón exhibieron una alteración del sesgo quiral en sentido contrario a las agujas del reloj o CCW en el sentido de las agujas del reloj o CW.In adición, las células endoteliales vasculares umbilicales humanas o hUCÉricas que fueron tratadas con 12-o-tetradecanoil-forbol-13-acetato o TPA para activar la proteína quinasa C mostraron un cambio dependiente de la dosis de quiralidad celular de CW a CCW. Después de la siembra celular a los patrones, los productos químicos o medicamentos se pueden complementar con el medio para estudiar la respuesta, y el sistema transwell se puede incorporar para estudiar el cocultivo celular.
Este ensayo proporciona una herramienta eficiente para investigar la quiralidad multicelular en diferentes entornos experimentales y ofrece información importante sobre el papel de la quiralidad celular en diversos fenómenos y procesos biológicos.
