Production de souris génétiquement modifiées par micro-injection d'ovocytes

Résumé

La micro-injection d'ovocytes de souris est couramment utilisée à la fois pour la transgénèse classique ( c.-à-d. L'intégration aléatoire des transgènes) et le ciblage des gènes médié par CRISPR. Ce protocole examine les derniers développements en micro-injection, avec un accent particulier sur le contrôle de la qualité et les stratégies de génotypage.

Résumé

L'utilisation de souris génétiquement modifiées a contribué de manière significative aux études sur les processus physiologiques et pathologiques in vivo . L'injection pronucléaire des constructions d'expression d'ADN dans les ovocytes fécondés reste la technique la plus couramment utilisée pour générer des souris transgéniques pour une surexpression. Avec l'introduction de la technologie CRISPR pour le ciblage des gènes, l'injection pronucléaire dans les ovocytes fécondés a été étendue à la génération de souris knock-out et knockin. Ce travail décrit la préparation de l'ADN pour l'injection et la génération de guides CRISPR pour le ciblage des gènes, en mettant l'accent sur le contrôle de la qualité. Les procédures de génotypage nécessaires à l'identification des fondateurs potentiels sont essentielles. Des stratégies novatrices de génotypage qui profitent des capacités de "multiplexage" de CRISPR sont présentées ici. Les procédures chirurgicales sont également décrites. Ensemble, les étapes du protocole permettront la génération de genDes souris modifiées de manière sélective et pour l'établissement ultérieur de colonies de souris pour une pléthore de domaines de recherche, y compris l'immunologie, les neurosciences, le cancer, la physiologie, le développement et d'autres.

Introduction

Les modèles animaux, chez les vertébrés et les invertébrés, ont contribué à l'examen de la pathophysiologie des affections humaines telles que la maladie d'Alzheimer ^{1 , 2} . Ils sont également des outils précieux pour rechercher des modificateurs de maladies et pour finalement développer de nouvelles stratégies de traitement dans l'espoir d'un remède. Bien que chaque modèle ait des limites intrinsèques, l'utilisation des animaux comme modèles systémiques complets est essentielle à la recherche biomédicale. C'est parce que l'environnement physiologique métabolique et complexe ne peut pas être entièrement simulé dans la culture tissulaire.

À ce jour, la souris reste l'espèce de mammifère la plus commune utilisée pour la manipulation génétique car elle présente plusieurs avantages. Les processus physiologiques et les gènes associés aux maladies sont fortement conservés chez les souris et les humains. La souris a été le premier mammifère à avoir son génome complet séquencé (2002), un an avant le génome humainMoi (2003). Outre cette richesse de l'information génétique, la souris possède de bonnes capacités d'élevage, un cycle de développement rapide (6 semaines après la fertilisation jusqu'au sevrage) et une taille raisonnable. Tous ces avantages, couplés à des indicateurs physiologiques, tels que des couleurs de revêtement distinctes (requis pour les stratégies de croisement), ont fait de la souris un modèle attrayant pour la manipulation génétique. Notamment, au début de la génétique moderne, Gregor Mendel a commencé à travailler sur des souris avant de passer à des plantes ³ .

Les techniques de transfert de gènes ont entraîné la génération de la première souris transgénique il y a trois décennies ⁴ , initialement créée à l'aide de l'administration virale. Cependant, les chercheurs ont rapidement compris que l'un des principaux défis de la transgénèse de la souris était l'incapacité de contrôler le devenir de l'ADN exogène. Parce que l'administration virale de transgènes dans des ovocytes de souris a abouti à des copies multiples intégrées au hasard dans le génome, la possibilitéY d'établir des lignes transgéniques ultérieures était limité.

Une telle limitation a été surmontée lorsque Gordon et al. A généré la première ligne de souris transgénique par microinjection ^{5 , 6} . Cela a commencé l'ère de la technologie de l'ADN recombinant, et les paramètres influençant le résultat d'une session de micro-injection ont été largement étudiés ⁷ . Bien que la micro-injection ne permette pas le contrôle sur le site d'intégration du transgène (qui aboutit finalement à des niveaux d'expression spécifiques pour chaque souris fondatrice), l'avantage principal de la microinjection pronucléaire reste la formation de concatemers ( c.-à-d. Des tableaux de multiples copies du transgène, Liés en série) avant intégration génomique ⁵ . Cette caractéristique a été utilisée au cours des années pour établir des milliers de lignes de souris transgéniques qui surexpriment un gène d'intérêt. Depuis lors, la transgénèse, la aModification artificielle du génome d'un organisme, a été largement utilisée pour identifier le rôle des gènes simples dans l'apparition de maladies.

Une autre réalisation clé dans la manipulation du génome de la souris a été atteinte lorsque Mario Capecchi a perturbé avec succès un seul gène à la souris, ouvrant l'ère du ciblage des gènes ⁸ . Cependant, des inconvénients majeurs ont rapidement émergé du ciblage génétique basé sur les cellules ES, y compris les défis de la culture des cellules ES, le degré de chimérisme quelque peu variable et la durée du processus ( c'est-à-dire 12-18 mois minimum pour obtenir la souris) .

Récemment, les progrès dans les nouvelles technologies, telles que les endonucléases modifiées ( p. Ex., Les nucléases de doigts de zinc (ZFN), les nucléases effectrices de l'activateur de la transcription (TALEN) et les répétitions palindromiques courtes (CRISPR / Cas9) classées régulièrement sont apparues comme des méthodes alternatives Accélérer le processus de ciblage des gènes dans le microE ^{9 , 10} . Ces endonucléases peuvent être facilement injectées dans des ovocytes de souris par micro-injection, ce qui permet de générer des souris ciblées par gène en 6 semaines seulement.

Depuis le premier rapport sur l'utilisation de CRISPR pour l'édition génomique ¹¹ , ce système immunitaire adaptatif bactérien a remplacé ZFN et TALEN en raison de ses nombreux avantages, y compris la facilité de la synthèse et la capacité de cibler de multiples loci à la fois (appelés "multiplexage" "). Le CRISPR a d'abord été utilisé pour le ciblage des gènes chez la souris ¹² et a depuis été appliqué à d'innombrables espèces, des plantes aux humains ^{13 , 14} . À ce jour, aucun rapport d'une seule espèce n'est résistant à l'édition du génome CRISPR.

Les deux principales étapes limitantes de la génération de souris transgéniques sont l'injection d'ovocytes et la réimplantationDe ces ovocytes chez des femelles pseudo-grossières. Bien que cette technique ait été décrite par nous ¹⁵ et d'autres ¹⁶ , des améliorations techniques récentes dans l'embryologie de souris et les techniques de transfert de gènes ont révolutionné le processus de génération de souris génétiquement modifiées. Ces améliorations seront décrites ici.

Protocole

Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité des soins et de l'éthique des animaux de l'Université de New-Galles du Sud.

1. Préparation du transgène (intégration aléatoire)

1. Électrophorèse analytique en gel d'agarose.
   1. Décrivez le plasmide pour acciser le transgène en utilisant des enzymes appropriées (1 heure d'incubation) ou des enzymes à digestion rapide (15 à 30 minutes d'incubation) dans un thermocycleur en suivant les recommandations du fabricant (voir la figure 2A et sa légende).
   2. Mélanger un gel d'agarose à 1% tris-acétate-éthylènediaminetétraacétique (EDTA) (TEA), coloré avec 0,5 à 1,0 μg / ml de bromure d'éthidium (EtBr).
      REMARQUE: faites preuve de prudence lorsque vous utilisez EtBr; C'est un puissant mutagène. Utilisez un équipement de protection individuelle approprié (reportez-vous à la fiche technique de sécurité).
   3. Chargez un marqueur de masse moléculaire de 1 kb.
   4. Chargez les fragments linéarisés ( c'est-à-dire le transgène et le squelette).
   5. Faire fonctionner l'électrophorèse à 100 V pendant 45 minutes.
   6. Visualisez le gel sur un transilluminateur ultraviolet (UV) pour vérifier que la digestion est terminée et pour confirmer la taille correcte du transgène ( c.-à-d., 7 338 pb, voir Figure 2A ).
2. Électrophorèse préparative en gel d'agarose.
   1. Lancer un gel d'agarose TAE à 1% coloré avec une tache de gel à faible toxicité. Chargez 8 portions aliquotes (1 μg chacune) de transgène linéarisé sans marqueur de poids moléculaire et effectuez l'électrophorèse à 100 V pendant 45 minutes. Utilisez un scalpel pour acciser toutes les 8 bandes correspondant au transgène linéarisé.
   2. Extrayez l'ADN en utilisant un kit d'extraction de gel en suivant les recommandations du fabricant (voir la Table des matériaux ).
      1. Faire fondre les fragments de gel à 50 ° C dans des tubes de 1,5 mL pendant au moins 15 minutes. Précipiter avec de l'isopropanol puis ajouter le tampon de liaison.
      2. Combinez l'ensemble de la DNA en pipettant tout dans une colonne. Eluer dans un tampon de microinjection sans nucléase (Tris-HCl 8 mM et EDTA 0,15 mM). Filtrer par un filtre à microcentrifugeuse de 0,22 μm et centrifuger pendant 60 s à 12 000 x g.
   3. Mesurer la concentration et la qualité de l'ADN à l'aide d'un spectrophotomètre. Vérifiez que le rapport A260 / A280 est d'environ 1.8 ( c.-à-d., Pas de contamination par les protéines) et le rapport A260 / A230 est d'au moins 2,0 ( c.-à-d. Pas de contamination par les solvants organiques). Diluez jusqu'à 3 ng / μL dans un tampon de microinjection sans nucléase, une aliquote (20-50 μL) et gèlez à -20 ° C.

2. Synthèse des composants CRISPR (ciblage des gènes)

1. Cas9 mRNA.
   1. Diluer l'ARNm Cas9 (obtenu à partir d'une source commerciale, voir la Table des matériaux ) à une concentration de 1 μg / μL dans un tampon de microinjection sans nucléase.
   2. Aliquote dans 2 μL et libre Ze à -80 ° C.
2. RNA à guide unique (SgRNA).
   1. Identifiez les séquences génomiques à deux cibles souhaitées (guides) en utilisant un outil de conception de calcul permettant une activité potentiellement hors cible hors potentiel ¹⁷ .
      1. Pour le knockout génique, choisissez systématiquement deux guides situés à quelques centaines de paires de bases (bp), dans des directions opposées, et incluent le codon de départ du gène d'intérêt. Pour une réparation directe d'homologie, sélectionnez deux guides qui se chevauchent (dans la mesure du possible), dans des directions opposées.
         REMARQUE: à titre d'exemple, les guides suivants ont récemment été co-injectés avec succès pour perturber le premier exon du gène TPM4.2 :
         Guide 1: 5 'CGCCATCCAGTTCGCGCTGC 3';
         Guide 2: 5 'CAGAACGATTGAGCTATGGC 3'
   2. Commandez un ensemble d'amorces comme décrit dans le tableau 1 .
   3. Synthèse d'un modèle d'ADN linéaire.
      1. Diluer px330Ref "> 12 plasmide à 10 ng / μL dans de l'eau exempte de nuclease.
      2. Préparez le mélange maître comme indiqué dans le tableau 1 . Ajouter la polymérase à la fin et garder le mélange maître sur de la glace.
      3. Mélanger et diviser cela en 8 tubes PCR (19 μL / tube). Ajouter 1 μL de px330 par tube et exécuter la PCR dans les conditions suivantes: 1 min à 98 ° C; 40 cycles de 98 ° C pendant 10 s, 64 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 15 s; Et un allongement final à 72 ° C pendant 5 min. Maintenir à 4 ° C.
      4. Purifier les produits de PCR en utilisant un kit de purification par PCR (voir la Table des matériaux ), un collecteur et une source de vide (pour un traitement plus rapide). Appliquer la force maximale de l'aspirateur ( c'est-à-dire 8 mbar).
         1. Ajouter 5 volumes (100 μL) de tampon de liaison à 1 volume de l'échantillon de PCR et mélanger.
         2. Placez une colonne de spin de la membrane de silice (fournie) dans un tube de collecte (fourni) de 2 ml pour la centrifugation ou sur le collecteur pour le processus sous videIng. Pour lier l'ADN, appliquer successivement tous les 8 échantillons à la colonne et aspirer ou centrifuger pendant 60 s à 12 000 xg pour chaque charge.
         3. Pour laver, ajouter 0,75 ml de tampon de lavage (tampon PE) à la colonne et aspirater ou centrifuger pendant 60 s à 12 000 x g. Centrifuger la colonne pendant 60 s à 12 000 xg pour éliminer l'éthanol résiduel.
         4. Placez la colonne dans un tube de microcentrifugeuse propre de 1,5 ml. Pour éluer l'ADN, ajouter 30 μL d'eau exempte de nuclease au centre de la membrane, laisser reposer la colonne pendant 1 min et centrifuger pendant 60 s à 12 000 g.
      5. Mesurer la concentration en utilisant un spectrophotomètre; Généralement, la concentration devrait être de 100 ng / μL ou plus. Vérifiez que le rapport A260 / A280 est d'environ 1.8 ( c.-à-d., Pas de contamination par les protéines) et le rapport A260 / A230 est d'au moins 2,0 ( c.-à-d. Pas de contamination par les solvants organiques).
   4. Transcription in vitro utilisant un kit de synthèse d'ARN T7.
      1. Préparez-vousIl maîtrise le mélange, comme indiqué dans le tableau 1 , et incube pendant 3 h à 37 ° C dans un thermocycleur. Ajouter 28 μL d'eau libre de nuclease et 2 μL de DNase I et incuber pendant encore 15 minutes à 37 ° C dans un thermocycleur.
   5. Purification d'ARN à l'aide de colonnes de spin.
      1. Dissoudre la poudre contenue dans la colonne de spin fournie dans 650 μL de tampon de microinjection sans nuclease, en éliminant soigneusement toutes les bulles d'air. Capter le tube et hydrater pendant 5 à 15 min à température ambiante.
      2. Retirez le capuchon bleu en bas et placez la colonne dans un tube de 2 ml. Centrifuger pendant 2 min à 750 xg et la température ambiante. Placez la colonne dans un tube frais de 1,5 ml et appliquez 50 μL de la solution d'ARN dans le centre, sans toucher la paroi de la colonne. Faire tourner la colonne pendant 2 min à 750 x g.
      3. Mesurer la concentration d'ARN à l'aide d'un spectrophotomètre (le rendement typique d'une réaction est de 30 à 50 μg). Vérifiez que le rapport A260 / A280 est unLe cycle 2.0 ( c.-à-d. Pas de contamination par les protéines) et le rapport A260 / A230 est d'au moins 2,0 ( c.-à-d. Pas de contamination par les solvants organiques). Rangez les sgRNA à -80 ° C jusqu'à l'utilisation.
      4. Évaluer la qualité de l'ARN en utilisant les gels TAE à 1% habituellement utilisés pour l'électrophorèse de l'ADN. Exécutez 200-400 ng du modèle d'ADN et le sgRNA correspondant en parallèle. La bande d'ARN (≈ 100 pb) devrait être légèrement plus grande que la bande d'ADN (voir la figure 3A ).

3. Modèle de donateur

1. Commander des oligonucleotides monocaténaires synthétisés dans le commerce (ssOligos, voir la Table des matériaux ) pour des mutations ponctuelles ou pour l'intégration de petites séquences jusqu'à 50 pb; Les bras d'homologie sont généralement de 60 à 90 paires de long.
2. Pour des insertions plus importantes, utilisez un plasmide donneur comme modèle. Générer un plasmide approprié en utilisant soit la méthode classique de clonage, soit la synthèse de novo à partir d'unSource commerciale.
   REMARQUE: Un minimum de 800 pb par bras d'homologie est recommandé. La taille de l'épine dorsale n'a aucune influence sur l'efficacité de la réparation directe d'homologie (HDR).

4. Mélange d'injection

1. Diluer l'ARNm de Cas9 à 50 ng / μL et les sgRNAs à 12,5 ng / μL (25 ng / μL au total) en utilisant un tampon de microinjection sans nucléase pour les expériences de knock-out du gène. Ajouter le modèle de donneur (ssOligo ou plasmide) à une concentration de 200 ng / μL pour des expériences d'édition de génome basées sur la réparation directe d'homologie.
   REMARQUE: Les volumes de dilution peuvent être facilement déterminés à l'aide d'outils en ligne, tels qu'un calculateur de remise en suspension ¹⁸ .
2. Conservez chaque aliquote sur la glace lors de la séance de microinjection et jettez ensuite (ne pas congeler le mélange d'injection).

5. Vasectomie scrotale

NOTE: Deux types de vasectomie sont fréquemment utilisés chez les souris: abdominaux et scrotales. Le dernierEst moins invasive et a déjà été décrite ¹⁵ .

1. Autoclave tous les instruments chirurgicaux en acier inoxydable.
2. Déterminer le poids de la souris à l'aide d'une balance de pesée et anesthésier les mâles par injection intrapéritonéale (IP) avec des anesthésiques injectables (kétamine 100 mg / kg, xylazine 10 mg / kg).
3. Surveillez la perte de réflexe de pincement et une fois que la souris est sédée, placez-la sur un coussin chauffant.
4. Désinfectez la peau autour des testicules avec des lingettes alternées d'un antiseptique topique tel que la chlorhexidine et 70% d'éthanol.
5. Empêcher les testicules dans le sac scrotale et faire une incision cutanée avec un scalpel.
6. Visualisez les testicules, la cauda epididyme et le canal déférent.
7. Prenez le canal déférent avec une pince, maintenez-le et cautérisez de chaque côté de la pince pour enlever 3 mm du canal déférent.
8. Effectuez la même procédure sur le deuxième testicule.
9. Fermez les incisions cutanées avec des clips enroulés et surveillez lesLa souris étroitement jusqu'à la récupération complète.

6. Superovulation (donneurs d'ovocytes) et accouplement temporel (femelles pseudo-enceintes)

NOTE: La technique pour générer un nombre approprié d'ovocytes fécondés et de femelles adoptives branchées pour la réimplantation a été décrite ailleurs ¹⁵ .

1. Injecter 10 femelles ip avec 5 UI de gonadotrophine sérique de jument enceinte (PMSG, dans 100 μL) vers 12 heures le jour 1.
2. Injecter les femelles ip avec 5 UI de gonadotrophine chorionique humaine (hCG, dans 100 μL) 46-48 h plus tard (environ 11 heures le jour 3).
3. Entraînez immédiatement les femelles avec des mâles à un seul logement pendant la nuit.

7. Injections pronucléaires (intégration aléatoire) et cytoplasmiques (ciblage par voie génétique)

1. Culler les souris superovulées par dislocation cervicale, exposer l'abdomen et accéder aux ovaires et oviductes, comme décrit précédemment ¹⁵ . Dissectionnez le oÉvacue et récolte les cumulus-ovocytes-complexes (COC) sous un stéréomicorscope ¹⁵ . Placez-les dans une goutte de milieu d'optimisation de potassium simplex complétée par des acides aminés (KSOMaa) selon la méthode traditionnelle ¹⁵ .
2. Purifier les ovocytes en ajoutant approximativement 1 μl d'hyaluronidase (10 mg / mL) à la goutte du milieu KSOMaa en utilisant une embouchure aspirante et placer le plat dans un incubateur de CO ₂ à 37 ° C / 5% pendant 30 s à 1 min.
3. Lavez les ovocytes avec 4 gouttes fraîches de milieu KSOMaa à l'aide de la bouche aspirante et transférez-les à une dernière goutte de milieu KSOMaa recouvert d'huile minérale (environ 2 ml). Placez le plat dans l'incubateur à 37 ° C / 5% CO ₂ jusqu'à ce que les ovocytes soient prêts à l'injection.
4. Injection pronucléaire (intégration aléatoire).
   1. Visualiser les œufs sous microscope stéréoscopique et transférer environ 50 oeufs dans la chambre d'injection (une droP de milieu M2 recouvert d'huile minérale) à l'aide de la bouche aspirante.
   2. Transférer la chambre d'injection au microscope inversé et injecter les ovocytes fertilisés (deux pronucléés visibles) avec quelques picolitres du mélange d'injection, ciblant un pronucleus (l'un des pronuclei peut être ciblé). Visualisez une injection réussie en observant l'enflure du pronucleus.
5. Injection cytoplasmique (ciblage des gènes).
   1. Transférer environ 50 oeufs à une goutte de KSOMaa contenant 5 μg / mL de cytochalasine B en utilisant la bouche et incuber pendant 5 min dans l'incubateur à 37 ° C / 5% CO ₂ .
   2. Transférer les oeufs dans la chambre d'injection à l'aide de la bouche.
   3. Injecter quelques picolitres du mélange d'injection dans le cytoplasme à très basse pression (50-100 hPa), en utilisant la pression de compensation du micro-injecteur automatisé dans la mesure du possible.
   4. Après l'injection, transférez les ovocytes dans une goutte de KSOMaa (à l'aide de la bouche) et les garder dans l'incubateur à 37 ° C / 5% de CO ₂ , jusqu'à ce qu'ils soient chargés pour la réimplantation dans l'oviducte de femelles pseudo-enceintes.

8. Réimplantation

1. Autoclave tous les instruments chirurgicaux en acier inoxydable.
2. Déterminer le poids de la souris à l'aide de l'échelle de pesée et anesthésier les femelles par injection intrapéritonéale (IP) avec des anesthésiques injectables (kétamine 100 mg / kg, xylazine 10 mg / kg).
3. Surveillez la perte de réflexe de pincement et une fois que la souris est sédée, placez-la sur un coussin chauffant.
4. Accrochez une grande zone de la fourrure autour de la ligne médiane dorsale de la souris femelle.
5. Désinfectez la peau exposée avec des lingettes alternées d'un antiseptique topique tel que la chlorhexidine et l'éthanol à 70%.
6. Exposer le tractus reproducteur selon la méthode traditionnelle ¹⁵ . Faire une incision de la peau de 1 cm de long parallèlement à la ligne médiane dorsale, couper le muscle et saisir le coussinet grasUne pince, puis tirez doucement l'ovaire jusqu'à ce que son oviduct et son utérus soient clairement visibles.
7. Fixez le coussinet gras avec une pince à vaisseau. Visualiser l'oviducte sous microscope stéréoscopique et utiliser une paire de micro-ciseaux font une incision dans la paroi de l'oviduct quelques millimètres en amont de l'ampoule.
8. Sous le microscope stéréoscopique, charger 25 oeufs micro-injectés dans le capillaire en verre relié à la bouche (le diamètre intérieur du capillaire devrait avoir une largeur d'environ 120 μm). Introduire le capillaire en verre dans l'oviducte et expulser jusqu'à ce qu'une bulle d'air soit visible à l'intérieur de l'ampoule.
9. Retirez doucement le capillaire en verre et placez le tractus reproducteur dans l'abdomen. Suture l'incision avec des sutures chirurgicales 3-0 non absorbables, puis fermez-les avec des clips enroulés. Surveillez la souris de près jusqu'à la récupération complète.

9. Stratégies de génotypage / séquençage

REMARQUE: Isoler le génomiqueL'ADN provenant de biopsies de queue ou d'oreille de 2 mm, conformément à la réglementation sur l'éthique des animaux.

1. Extraction rapide d'ADN génomique (intégration aléatoire).
   1. Lyse les échantillons de tissus (~ 2 mm) à 95 ° C pendant 1 h dans 100 μl de réactif de lyse alcalin (hydroxyde de sodium 25 mM et EDTA 0,2 mM, pH = 12).
   2. Ajouter 100 μl de réactif neutralisant (Tris-HCl 40 mM, pH = 5).
   3. Centrifugez pendant 5 min à 12 000 g et 4 ° C.
2. Extraction d'ADN génomique de haute qualité (ciblage des gènes).
   1. Ajouter 500 μl de tampon de queue (50 mM de Tris, pH = 8, 100 mM d'EDTA, pH = 8, 100 mM de NaCl, 1% de SDS et 0,5 mg / mL de protéinase K, fraîchement ajoutée).
   2. Incuber pendant une nuit à 55 ° C.
   3. Mélanger pendant 5 minutes en inversant (pas de vortex).
   4. Ajouter 250 μl de NaCl saturé (6 M) et mélanger pendant 5 minutes en inversant (ne pas tourbillonner).
   5. Faire tourner pendant 5 à 10 min à 12 000 xg et 4 ° C et verser le surnageant dans un nouveau tube.
   6. Ajouter 500 μl d'isopropanol et mélanger pendant 5 minutes en inversant (ne pas tourbillonner).
   7. Faire tourner pendant 10 min à 12 000 xg et température ambiante.
   8. Décanter le surnageant (la pastille est invisible et colle au tube).
   9. Laver avec 1 ml d'éthanol à 70%.
   10. Tournez pendant 5-10 min à 12 000 xg et température ambiante. Retirez le surnageant avec précaution, car la pastille blanche n'est plus collante et peut être perdue.
   11. Séchez l'air pendant environ 1 h.
   12. Ajouter 400 μl de tampon TE (Tris 10 mM et EDTA 1 mM, pH = 8).
   13. Dissoudre l'ADN à 55-60 ° C pendant 2 h.
3. Design d'amorçage.
   1. Conception d'amorces d'un minimum de 20 pb de long à l'aide d'un outil de calcul ¹⁹ .
      REMARQUE: pour l'intégration aléatoire, les amorces doivent s'hybrider avec le transgène, générant un fragment distinct de 200 à 800 pb. Pour le ciblage des gènes, concevez les amorces afin qu'elles s'hybrident avec l'ADN génomique, générant une f distincteRamenant quelques centaines de pixels autour des sites coupés. Pour les grandes insertions, les amorces peuvent s'asseoir sur le transgène, mais la confirmation de l'intégration ciblée devrait ensuite être effectuée à l'aide de la marche à l'avant ou d'une technique similaire.
4. Génotypage par PCR.
   1. Pour chaque modification génomique, concevez un nouveau protocole de PCR et testez-le de manière empirique. Considérons la longueur du fragment généré et la température de fusion (Tm) de chaque paire d'amorces.
5. Séquençage.
   1. Pour le ciblage des gènes, envoyez des produits de PCR à un fournisseur de services de séquençage Sanger.

Résultats

Ci-dessous, les flux de travail pour la micro-injection dans le cas de l'intégration aléatoire et le ciblage des gènes médiés par CRISPR sont décrits ( Figure 1 ).

Figure 1: Flux de travail typique pour la génération de souris génétiquement modifiées. Pour une intégration alé...

Discussion

Etapes critiques dans le protocole

On sait que la génération de souris génétiquement modifiées présente un défi technique. Cependant, le protocole présenté ici est une méthode optimisée et simplifiée qui permet de maîtriser et de dépanner la technique en un temps record. Il faut deux étapes pour réussir la technique. Tout d'abord, la synthèse de modèles d'ADN linéaires (pour la synthèse des sgRNA) peut être obtenue sans chlorure de magnésium (MgCl ₂ ). C...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micropipette 0.1-2.5 ul	Eppendorf	4920000016
Micropipette 2-20 ul	Eppendorf	4920000040
Micropipette 20-200 ul	Eppendorf	4920000067
Micropipette 100-1000 ul	Eppendorf	4920000083
Molecular weight marker	Bioline	BIO-33025	HyperLadder 1kb
Molecular weight marker	Bioline	BIO-33056	HyperLadder 100 bp
Agarose	Bioline	BIO-41025
EDTA buffer	Sigma-Aldrich	93296	10x - Dilute to 1x
Ethidium bromide	Thermo Fisher Scientific	15585011
SYBR Safe gel stain	Invitrogen	S33102
Gel extraction kit	Qiagen	28706
PCR purification kit (Qiaquick)	Qiagen	28106
Vacuum system (Manifold)	Promega	A7231
Nuclease-free microinjection buffer	Millipore	MR-095-10F
Ultrafree-MC microcentrifuge filter	Millipore	UFC30GV00
Cas9 mRNA	Sigma-Aldrich	CAS9MRNA
CRISPR expressing plasmid (px330)	Addgene	42230
Nuclease free water	Sigma-Aldrich	W4502
Phusion polymerase	New England Biolabs	M0530L
T7 Quick High Yield RNA kit	New England Biolabs	E2050S
RNA purification spin columns (NucAway)	Thermo Fisher Scientific	AM10070
ssOligos	Sigma-Aldrich	OLIGO STANDARD
Donor plasmid	Thermo Fisher Scientific	GeneArt
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3884
KSOMaa embryo culture medium	Zenith Biotech	ZEKS-100
Mineral oil	Zenith Biotech	ZSCO-100
M2 Medium	Sigma-Aldrich	M7167
Cytochalasin B	Sigma-Aldrich	C6762
Mouthpiece	Sigma-Aldrich	A5177
Glass microcapillaries	Sutter Instrument	BF100-78-10
Proteinase K	Applichem	A3830.0100
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	91150-20
Iris scissors	Fine Science Tools	91460-11
Vessel clamp	Fine Science Tools	18374-43
Wound clips	Fine Science Tools	12040-01
Clips applier	Fine Science Tools	12018-12
Micro-scissors	Fine Science Tools	15000-03
Cauterizer	Fine Science Tools	18000-00
Non-absorbable surgical sutures (Ethilon 3-0)	Ethicon	1691H
5% CO2 incubator	MG Scientific	Galaxy 14S
Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	Nanodrop 2000c
Thermocycler	Eppendorf	6321 000.515
Electrophoresis set up	BioRad	1640300
UV Transilluminator	BioRad	1708110EDU
Thermocycler	Eppendorf	6334000069
Stereoscopic microscope	Olympus	SZX7
Inverted microscope	Olympus	IX71
2x Micromanipulators	Eppendorf	5188000.012
Oocytes manipulator	Eppendorf	5176000.025
Microinjector (Femtojet)	Eppendorf	5247000.013
Mice C57BL/6J strain	Australian BioResources	C57BL/6JAusb