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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

La microinezione di ovociti del mouse è comunemente utilizzata sia per il transgenesi classico ( cioè l'integrazione casuale dei transgeni) sia per il targeting del gene mediato da CRISPR. Questo protocollo riesamina gli ultimi sviluppi della microinjection, con particolare attenzione alle strategie di controllo della qualità e genotipizzazione.

Abstract

L'uso di topi geneticamente modificati ha contribuito in maniera significativa agli studi sui processi fisiologici e patologici in vivo . L'iniezione pronucleare di espressioni del DNA in oociti fecondati rimane la tecnica più comunemente utilizzata per generare topi transgenici per sovraespressione. Con l'introduzione della tecnologia CRISPR per il targeting genico, l'iniezione pronucleare in oociti fecondati è stata estesa alla generazione di topi di knockout e knockin. Questo lavoro descrive la preparazione del DNA per l'iniezione e la generazione di guide CRISPR per il targeting genico, con particolare attenzione al controllo di qualità. Le procedure di genotipizzazione necessarie per l'identificazione dei potenziali fondatori sono critiche. Le strategie innovative di genotipizzazione che sfruttano le funzionalità "multiplexing" di CRISPR sono qui presentate. Sono inoltre descritte procedure chirurgiche. Insieme, i passaggi del protocollo consentiranno la generazione di genI topi eticamente modificati e per la successiva istituzione di colonie del mouse per una pletora di campi di ricerca, tra cui immunologia, neuroscienza, cancro, fisiologia, sviluppo e altri.

Introduzione

I modelli animali, sia in vertebrati che in invertebrati, sono stati strumentali ad esaminare la fisiopatologia delle condizioni umane come la malattia di Alzheimer 1 , 2 . Sono anche strumenti preziosi per la ricerca di modificatori della malattia e per sviluppare in ultima analisi nuove strategie di trattamento nella speranza di una cura. Sebbene ogni modello abbia limiti intrinseci, l'uso degli animali come interi modelli sistemici è fondamentale per la ricerca biomedica. Questo perché l'ambiente fisiologico metabolico e complesso non può essere interamente simulato nella cultura del tessuto.

Fino ad oggi, il topo rimane la specie mammiferi più diffusa per la manipolazione genetica perché presenta diversi vantaggi. I processi fisiologici e i geni associati alle malattie sono altamente conservati tra topi e esseri umani. Il topo è stato il primo mammifero a sequenziare il proprio genoma (2002), un anno prima del genoma umanoMe (2003). Oltre a questa ricchezza di informazioni genetiche, il mouse ha buone capacità di allevamento, un veloce ciclo di sviluppo (6 settimane dalla fecondazione allo svezzamento) e una dimensione ragionevole. Tutti questi vantaggi, accoppiati con indicatori fisiologici, come i colori del cappotto distinti (richiesti per le strategie di attraversamento), hanno reso il topo un modello attraente per la manipolazione genetica. Soprattutto, nella prima età della genetica moderna, Gregor Mendel ha iniziato a lavorare sui topi prima di passare alle piante 3 .

Le tecniche di trasferimento del gene hanno determinato la generazione del primo topo transgenico più di tre decenni fa 4 , inizialmente creato usando la consegna virale. Tuttavia, i ricercatori hanno subito capito che una delle principali sfide del transgenesi del mouse era l'incapacità di controllare il destino del DNA esogeno. Poiché la consegna virale di transgeni nei oociti del mouse ha portato a copie multiple integrate casualmente nel genoma, la possibilitY di stabilire linee transgeniche successive era limitata.

Una tale limitazione è stata superata quando Gordon et al. Ha generato la prima linea del mouse transgenica mediante microinjection 5 , 6 . Ciò ha inizio l'epoca della tecnologia del DNA ricombinante ei parametri che influenzano l'esito di una sessione di microinjection sono stati ampiamente studiati 7 . Sebbene la microinjection non consente di controllare il sito di integrazione del transgene (che alla fine determina livelli di espressione specifici per ogni mouse fondatore), il vantaggio principale della microinjection pronucleare rimane la formazione di concatenanti ( cioè, array di copie multiple del transgene, Collegati in serie) prima dell'integrazione genomica 5 . Questa caratteristica è stata utilizzata nel corso degli anni per stabilire migliaia di linee di topi transgenici che sovraespressionano un gene di interesse. Da allora, la transgenesis, l'aModificazione rtificale del genoma di un organismo, è stata ampiamente utilizzata per identificare il ruolo dei geni singoli nel verificarsi di malattie.

Un altro successo chiave nella manipolazione del genoma del mouse è stato raggiunto quando Mario Capecchi ha interrotto con successo un singolo gene nel topo, aprendo l'era del gene targeting 8 . Tuttavia, i principali inconvenienti sono emersi rapidamente dal targeting genico basato su cellule ES, incluse le sfide di coltura delle cellule ES, il grado di chimerismo un po 'variabile e la durata del processo ( ovvero 12-18 mesi, minimo per ottenere il topo) .

Recentemente, i metodi alternativi per le nuove tecnologie, come le endonucleasi ingegnerizzate ( es. Le nucleasi a dito di zinco (ZFN), le nucleasi efficace di attivazione della trascrizione (TALEN) e le cluster ripetute palindromiche brevi (CRISPR / Cas9) Accelerare il processo di targeting genico nel micE 9 , 10 . Queste endonucleasi possono essere facilmente iniettate in oociti del mouse mediante microinjection, permettendo la generazione di topi mirati per il gene in appena 6 settimane.

Dalla prima relazione sull'utilizzo di CRISPR per la modifica del genoma 11 , questo sistema immunitario adattativo batterico ha sostituito ZFN e TALEN a causa dei suoi molti vantaggi, tra cui la facilità di sintesi e la capacità di individuare contemporaneamente più loci (indicati come "multiplexing "). CRISPR è stato utilizzato per l'individuazione genica nei topi 12 e da allora è stato applicato a innumerevoli specie, dalle piante agli esseri umani 13 , 14 . Ad oggi non esiste alcuna relazione di una singola specie resistente al montaggio del genoma CRISPR.

Le due principali fasi di limitazione della generazione di topi transgenici sono l'iniezione di oociti e la reimplantazioneDi questi oociti in femmine pseudo-incinte. Anche se questa tecnica è stata descritta da noi 15 e altri 16 , i recenti miglioramenti tecnici nell'embrione del topo e nelle tecniche di trasferimento del gene hanno rivoluzionato il processo di generazione di topi geneticamente modificati. Questi miglioramenti saranno descritti qui.

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Protocollo

Tutte le procedure sono state approvate dall'Università del Nuovo Galles del Sud.

1. Preparazione del transgene (integrazione casuale)

  1. Elettroforesi analizzante per gel agarosio.
    1. Digestare il plasmide per accise il transgene usando enzimi appropriati (1 h di incubazione) o enzimi digestivi (15-30 minuti di incubazione) in un termociclista seguendo le raccomandazioni del produttore (vedere la figura 2A e la sua leggenda).
    2. Condurre un agarosio di 1% di tris-acetato-etilendiammeto-tetraacetico (EDTA) (TEA), colorato con 0,5-1,0 μg / ml di etidio bromuro (EtBr).
      NOTA: usare cautela quando si utilizza EtBr; È un mutageno potente. Utilizzare adeguati dispositivi di protezione individuale (consultare la scheda di sicurezza dei materiali).
    3. Caricare un marker molecolare di 1 kb.
    4. Caricare i frammenti linearizzati ( cioè transgene e spina dorsale).
    5. Eseguire l'elettroforesi a 100 V per 45 minuti.
    6. Visualizzare il gel su un transilluminatore ultravioletto (UV) per verificare che la digestione sia completa e confermare la giusta dimensione del transgene ( vale a dire 7.338 bp; vedere la figura 2A ).
  2. Elettroforesi preparato con agarosio gel.
    1. Portare un gel agarosico di TAE 1% macchiato con una macchia di gel a bassa tossicità. Caricare 8 aliquote (1 μg ciascuna) di transgene linearizzato senza marcatore di peso molecolare e eseguire l'elettroforesi a 100 V per 45 minuti. Utilizzare un bisturi per accise tutte le 8 bande corrispondenti al transgene linearizzato.
    2. Estrarre il DNA utilizzando un kit di estrazione del gel seguendo le raccomandazioni del produttore (vedere la tabella dei materiali ).
      1. Sciogliere i frammenti di gel a 50 ° C in tubi da 1,5 ml per almeno 15 minuti. Precipitare con isopropanolo e quindi aggiungere il tampone di legame.
      2. Combina l'intero DNA pipettandolo tutto in una colonna. Eluire nel tampone di microinjection senza nucleasi (8 mM Tris-HCl e 0,15 mM EDTA). Filtrare attraverso un filtro da microfiltrazione da 0,22 μm e centrifugare per 60 s a 12,000 x g.
    3. Misurare la concentrazione e la qualità del DNA utilizzando uno spettrofotometro. Controllare che il rapporto A260 / A280 sia di circa 1,8 ( cioè, nessuna contaminazione da proteine) e il rapporto A260 / A230 sia almeno 2,0 ( cioè nessuna contaminazione da solventi organici). Diluire fino a 3 ng / μl in tampone di microinjection privo di nucleasi, aliquota (20-50 μL) e congelare a -20 ° C.

2. Sintesi dei componenti CRISPR (targeting del gene)

  1. Cas9 mRNA.
    1. Diluire l'mRNA Cas9 (ottenuta da una fonte commerciale, vedere la Tabella dei Materiali ) ad una concentrazione di 1 μg / μl in tampone di microinjection privo di nucleasi.
    2. Aliquota in 2 μL e libera Ze a -80 ° C.
  2. Single-guide RNA (SgRNA).
    1. Identificare le sequenze genomiche a due bersodi (guide) usando uno strumento di progettazione computazionale che consenta l'attività minima potenziale fuori bersaglio 17 .
      1. Per il knockout genico, selezionare sistematicamente due guide situate in centinaia di coppie di base (bp), in direzioni opposte, e includere il codone iniziale del gene di interesse. Per la riparazione diretta dell'omologia, selezionare due guide sovrapposte (ove possibile), in direzioni opposte.
        NOTA: ad esempio, le seguenti guide sono state recentemente co-iniettate per interrompere il primo esone del gene TPM4.2 :
        Guida 1: 5 'CGCCATCCAGTTCGCGCTGC 3';
        Guida 2: 5 'CAGAACGATTGAGCTATGGC 3'
    2. Ordinare un insieme di primer come descritto nella tabella 1 .
    3. Sintetizzare un modello DNA lineare.
      1. Dilute px330Ref "> 12 plasmidi a 10 ng / μl in acqua priva di nucleasi.
      2. Preparare il mix master come indicato nella tabella 1 . Aggiungere la polimerasi alla fine e mantenere il mix master sul ghiaccio.
      3. Mescolare e suddividere questo in 8 tubi PCR (19 μL / tubo). Aggiungere 1 μL di px330 per tubo e eseguire il PCR nelle seguenti condizioni: 1 min a 98 ° C; 40 cicli di 98 ° C per 10 s, 64 ° C per 30 s e 72 ° C per 15 s; E un allungamento finale a 72 ° C per 5 min. Tenere a 4 ° C.
      4. Purificare i prodotti PCR utilizzando un kit di purificazione PCR (vedi tabella dei materiali ), un collettore e una sorgente di vuoto (per una più veloce elaborazione). Applicare la forza di vuoto massima ( vale a dire, 8 mbar).
        1. Aggiungere 5 volumi (100 μL) di buffer di legame a 1 volume del campione PCR e mescolare.
        2. Posizionare una colonna di spin di membrana di silice (in dotazione) in un tubo di raccolta da 2 mL fornito (per la centrifugazione) o sul collettore per il processo di vuotoing. Per legare il DNA, successivamente applicare tutti e 8 i campioni alla colonna e sottovuoto o centrifugare per 60 s a 12.000 xg per ogni carico.
        3. Per lavare, aggiungere 0,75 ml di tampone di lavaggio (tampone PE) alla colonna e sottovuoto o centrifugare per 60 s a 12.000 x g. Centrifugare la colonna per 60 s a 12.000 xg per eliminare l'etanolo residuo.
        4. Collocare la colonna in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml. Per eluire il DNA, aggiungere al centro della membrana 30 μL di acqua priva di nucleasi, lasciare la colonna per 1 min e centrifugare per 60 sec a 12.000 g.
      5. Misurare la concentrazione usando uno spettrofotometro; Tipicamente, la concentrazione dovrebbe essere di 100 ng / μL o superiore. Controllare che il rapporto A260 / A280 sia di circa 1,8 ( cioè, nessuna contaminazione da proteine) e il rapporto A260 / A230 sia almeno 2,0 ( cioè nessuna contaminazione da solventi organici).
    4. Trascrizione in vitro utilizzando un kit di sintesi T7 RNA.
      1. Preparare tMasterizzare come indicato nella tabella 1 e incubare per 3 ore a 37 ° C in un termociclatore. Aggiungere 28 μl di acqua priva di nucleasi e 2 μL di DNasi I e incubare per altri 15 minuti a 37 ° C in un termociclatore.
    5. RNA purificazione utilizzando colonne di spin.
      1. Sciogliere la polvere contenuta nella colonna di centrifuga fornita in 650 μl di tampone di microinjection senza nucleasi, rimuovendo con attenzione tutte le bolle d'aria. Coprire il tubo e l'idrato per 5 - 15 minuti a temperatura ambiente.
      2. Rimuovere il tappo blu in basso e collocare la colonna in un tubo da 2 ml. Centrifugare per 2 min a 750 xg e temperatura ambiente. Collocare la colonna in un nuovo tubo da 1,5 ml e applicare 50 μL di soluzione RNA in goccia al centro senza toccare la parete della colonna. Spin la colonna per 2 minuti a 750 x g.
      3. Misurare la concentrazione di RNA utilizzando uno spettrofotometro (la resa tipica di una reazione è di 30-50 μg). Controllare che il rapporto A260 / A280 sia aIl tondo 2,0 ( cioè, nessuna contaminazione da proteine) e il rapporto A260 / A230 è almeno 2,0 ( cioè nessuna contaminazione da solventi organici). Conservare i sgRNA a -80 ° C fino all'uso.
      4. Valutare la qualità dell'RNA utilizzando i gel TAE dell'1% usati normalmente per l'elettroforesi del DNA. Eseguire 200-400 ng del modello DNA e il corrispondente sgRNA in parallelo. La banda RNA (≈ 100 bp) dovrebbe essere leggermente più grande della fascia del DNA (vedi figura 3A ).

3. Modello del donatore

  1. Ordinare oligonucleotidi a singolo filamento sintetizzato commercialmente (ssOligos, vedere la tabella dei materiali ) per mutazioni puntuali o per l'integrazione di piccole sequenze fino a 50 bp; Le armi di omologia sono tipicamente 60-90 bp lunghe.
  2. Per gli inserimenti più grandi, utilizzare un plasmide donatore come modello. Generare un plasmide adatto utilizzando il metodo classico di clonazione o la sintesi de novo da unFonte commerciale.
    NOTA: Si consiglia un minimo di 800 bp per braccio di omologia. La dimensione della spina dorsale non ha alcuna influenza sull'efficienza della riparazione diretta dell'omologia (HDR).

4. Mix di iniezione

  1. Diluire l'mRNA di Cas9 a 50 ng / μL e gli sgRNA a 12,5 ng / μL (25 ng / μL in totale) utilizzando tampone di microinezione privo di nucleasi per esperimenti di eliminazione dei geni. Aggiungere il template del donatore (ssOligo o plasmide) ad una concentrazione di 200 ng / μL per esperimenti di modifica del genoma basati sulla riparazione diretta dell'omologia.
    NOTA: I volumi di diluizione possono essere facilmente determinati utilizzando strumenti online, come un calcolatore di resuspension 18 .
  2. Tenere ogni aliquota sul ghiaccio durante la seduta di microinjection e scartare dopo (non ri-congelare il mix di iniezione).

5. Vasectomia Scrotal

NOTA: due tipi di vasectomia vengono comunemente eseguiti nei topi: addominali e scrotal. L'ultimoÈ meno invasivo e è stato precedentemente descritto 15 .

  1. Autoclave tutti gli strumenti chirurgici in acciaio inox.
  2. Determinare il peso del mouse utilizzando una scala di peso e anestetizzare i maschi mediante iniezione intraperitoneale (ip) con anestetici iniettabili (ketamina 100 mg / kg, xilazina 10 mg / kg).
  3. Monitorare la perdita del riflesso del pizzico del piede e una volta che il topo è sedato, posizionarlo sopra un tappetino di riscaldamento.
  4. Disinfettare la pelle intorno ai testicoli con salviette alternate di antisettico topico come la clorexidina e il 70% di etanolo.
  5. Spingere i testicoli nel sac scrotal e fare un'incisione cutanea con un bisturi.
  6. Visualizzare il testis, cauda epididymis e vas deferens.
  7. Afferrare i vas deferens con le pinze, tenerlo e cauterizzare su ogni lato della pinza per rimuovere 3 mm dei vas deferens.
  8. Eseguire la stessa procedura sul secondo testicolo.
  9. Chiudere le incisioni della pelle con le clip della ferita e controllareTopo da vicino fino al completo recupero.

6. Superovulazione (donatori di Oociti) e Time-accoppiamento (Pseudo-pregnant Females)

NOTA: è stata descritta altrove la tecnica per generare un numero adeguato di ovociti fecondati e femmine da femmine collegate per la reimplantazione.

  1. Iniettare 10 femmine ip con 5 IU di gonadotropina sierica (PMSG) in mare di gravidanza, in circa 100 μL, intorno alle 12 del giorno 1.
  2. Iniettare le femmine ip con 5 UI di gonadotropina corionica umana (hCG; in 100 μL) 46-48 h più tardi (intorno alle 11 del mattino il giorno 3).
  3. Collegare immediatamente le femmine con i singoli maschi durante la notte.

7. Iniezioni pronucleari (integrazione casuale) e citoplasmatiche (targeting gene)

  1. Togliere i topi superovulati dalla dislocazione cervicale, esporre l'addome e accedere alle ovaie e agli ovuli, come descritto in precedenza 15 . Dissect the oPresenta e raccoglie i complessi cumulo-oociti (COC) sotto uno stereomicoroscopio 15 . Metterli in una goccia di mezzo di ottimizzazione di potassio simplex integrato con amminoacidi (KSOMaa) seguendo il metodo tradizionale 15 .
  2. Purificare gli oociti aggiungendo approssimativamente 1 μL di ialuronidasi (10 mg / ml) alla goccia del mezzo KSOMaa usando un pezzo di bocca dell'aspirazione e posizionare il piatto in un incubatore di CO 2 di 37 ° C / 5% per 30 s a 1 min.
  3. Lavare gli oociti con 4 gocce di mezzo di KSOMaa usando il pezzo della bocca dell'aspirazione e trasferirle in una goccia finale di mezzo KSOMaa sovrapposto ad olio minerale (circa 2 ml). Mettere il piatto nel incubatore di CO 2 di 37 ° C / 5% finché gli oociti sono pronti per l'iniezione.
  4. Iniezione pronucleare (integrazione casuale).
    1. Visualizzare le uova sotto il microscopio stereoscopico e trasferire circa 50 uova alla camera di iniezione (un droP di media M2 sovrapposti con olio minerale) utilizzando il pezzo di bocca dell'aspirazione.
    2. Trasferire la camera di iniezione al microscopio invertito e iniettare gli oociti fecondati (due pronuclei visibili) con pochi picolitri del mix di iniezione, puntando su un pronucleo (qualsiasi pronuclei può essere mirato). Visualizzare un'iniezione di successo osservando il gonfiore del pronucleo.
  5. Iniezione citoplasmatica (targeting gene).
    1. Trasferire circa 50 uova a una goccia di KSOMaa contenente 5 μg / mL di Cytochalasin B usando la bocca e incubare per 5 minuti nel 37 ° C / 5% CO 2 incubatore.
    2. Trasferire le uova alla camera di iniezione usando la bocca.
    3. Iniettare pochi picolitri del mix di iniezione nel citoplasma a una pressione molto bassa (50-100 hPa), utilizzando la pressione di compensazione del microinjector automatico, ove possibile.
    4. Dopo l'iniezione, trasferire gli oociti in una goccia di KSOMaa (usando la bocca) e tenerli nel incubatore di CO 2 di 37 ° C / 5% fino a caricare per reimplantare nell'ovulità delle femmine pseudo-incinte.

8. Reimplantazione

  1. Autoclave tutti gli strumenti chirurgici in acciaio inox.
  2. Determinare il peso del mouse utilizzando la bilancia di peso e anestetizzare le femmine mediante iniezione intraperitoneale (ip) con anestetici iniettabili (ketamina 100 mg / kg, xilazina 10 mg / kg).
  3. Monitorare la perdita del riflesso del pizzico del piede e una volta che il topo è sedato, posizionarlo sopra un tappetino di riscaldamento.
  4. Clip una grande area della pelliccia intorno alla linea mediana dorsale del mouse femminile.
  5. Disinfettare la pelle esposta con salviette alternate di antisettico topico come la clorexidina e il 70% di etanolo.
  6. Esporre il tratto riproduttivo seguendo il metodo tradizionale 15 . Fai un'incisione della pelle lunga 1 cm parallela alla linea mediana dorsale, taglia il muscolo e afferra il pad grasso wiUna pinza, quindi estrarre delicatamente l'ovario fino a quando il relativo oviduct attaccato e l'utero sono chiaramente visibili.
  7. Fissare il pasticcio grasso con un morsetto per vaso. Visualizzare l'ovidotto sotto il microscopio stereoscopico ed usando una coppia di micro-forbici effettuare un'incisione nella parete dell'ovidotto pochi millimetri a monte dell'ampolla.
  8. Sotto il microscopio stereoscopico, caricare 25 uova microinjected nel capillare di vetro collegato alla bocca pezzo (il diametro interno del capillare dovrebbe essere circa 120 μm di larghezza). Introdurre il capillare di vetro nell'ovidotto e espellere fino a quando una bolla d'aria è visibile all'interno dell'ampolla.
  9. Rimuovere delicatamente il capillare di vetro e posizionare il tratto riproduttivo nell'addome. Sutura l'incisione con 3-0 suture chirurgiche non assorbibili, quindi chiudere con le clip della ferita. Monitorare attentamente il mouse fino al completo recupero.

9. Strategie di Genotipizzazione / Sequencing

NOTA: Isolare la genomicaDNA da biopsie di coda o orecchie da 2 mm, seguendo le normative relative all'etica degli animali.

  1. Estrazione del DNA genomica veloce (integrazione casuale).
    1. Lyse i campioni di tessuto (~ 2 mm) a 95 ° C per 1 h in 100 μl di reagente alcalino di lisi (25 mM di sodio idrossido e 0,2 mM EDTA, pH = 12).
    2. Aggiungere 100 μl di reagente neutralizzante (40 mM Tris-HCl, pH 5).
    3. Centrifugare per 5 minuti a 12.000 g e 4 ° C.
  2. Estrazione genomica di DNA di alta qualità (targeting del gene).
    1. Aggiungere 500 μl di tampone di coda (50 mM Tris, pH 8, 100 mM EDTA, pH 8, 100 mM NaCl, SDS 1% e 0,5 mg / mL proteinasi K, aggiunto di nuovo).
    2. Incubare per una notte a 55 ° C.
    3. Mescolare per 5 minuti invertendo (non vorticarsi).
    4. Aggiungere 250 μl di NaCl saturo (6 M) e mescolare per 5 minuti invertendo (non vortice).
    5. Spin per 5-10 min a 12.000 xg e 4 ° C e versare il supernatante in un nuovo tubo.
    6. Aggiungere 500 μl di isopropanolo e mescolare per 5 minuti invertendo (non vortice).
    7. Spin per 10 min a 12.000 xg e temperatura ambiente.
    8. Decanta il surnatante (il pellet è invisibile e si attacca al tubo).
    9. Lavare con 1 mL di etanolo al 70%.
    10. Spin per 5-10 min a 12.000 xg e temperatura ambiente. Rimuove con attenzione il surnatante, poiché il pellet bianco non è più appiccicoso e può essere perso.
    11. Asciugare l'aria per ~ 1 h.
    12. Aggiungere 400 μl di tampone TE (10 mM Tris e 1 mM EDTA, pH = 8).
    13. Sciogliere il DNA a 55-60 ° C per 2 ore.
  3. Design primer.
    1. Progettare i primer per un minimo di 20 bp lungo utilizzando uno strumento di calcolo 19 .
      NOTA: Per l'integrazione casuale, i primers dovrebbero ibridizzare con il transgene, generando un frammento distinto di 200-800 bp. Per il targeting del gene, progettare i primer in modo che ibridizzino con il DNA genomico, generando una distinta fRagmentare qualche centinaio di bp intorno ai siti tagliati. Per i grandi inserimenti, i primers possono sedere sul transgene, ma la conferma dell'integrazione mirata dovrebbe essere successivamente eseguita usando il camminatore a primer o una tecnica simile.
  4. Genotipizzazione PCR.
    1. Per ogni modifica genomica, progettare un nuovo protocollo PCR e testarlo empiricamente. Si consideri la lunghezza del frammento generato e la temperatura di fusione (Tm) di ciascuna coppia di primer.
  5. Sequencing.
    1. Per il targeting gene, inviare i prodotti PCR a un fornitore di servizi di sequenziamento di Sanger.

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Risultati

Di seguito sono descritti i flussi di lavoro per la microinjection in caso di integrazione casuale e CRISPR-mediated gene targeting ( Figura 1 ).

figure-results-296
Figura 1: flusso di lavoro tipico per la generazione di topi modificati geneticamente. Per l'integrazione casuale, il transgene purificato vien...

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Discussione

Fasi critiche all'interno del protocollo

La generazione di topi geneticamente modificati è noto per essere tecnicamente impegnativa. Tuttavia, il protocollo qui presentato è un metodo ottimizzato e semplificato che consente di masterizzare e risolvere la tecnica in tempo record. Ci sono due fasi necessarie per il completamento della tecnica. In primo luogo, la sintesi di modelli lineari del DNA (per la sintesi di sgRNAs) può essere ottenuta senza cloruro di magnesio (MgCl2). Tuttavia, è...

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Divulgazioni

Gli autori forniscono servizi accademici di transgenesis nei topi attraverso l'Università del Nuovo Galles del Sud Mark Wainwright Analytical Center.

Riconoscimenti

Gli autori ringraziano il personale della struttura animale (BRC) per il loro sostegno continuo. Questo lavoro è stato finanziato dal National Health and Medical Research Council e dal Australian Research Council.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Micropipette 0.1-2.5 μLEppendorf4920000016
Micropipette 2 - 20 μLEppendorf4920000040
Micropipette 20 - 200 μLEppendorf4920000067
Micropipette 100 - 1,000 μLEppendorf4920000083
Molecular weight marker BiolineBIO-33025HyperLadder 1 kb
Molecular weight marker BiolineBIO-33056HyperLadder 100 bp
AgaroseBiolineBIO-41025
EDTA bufferSigma-Aldrich9329610x - Dilute to 1x
Ethidium bromideThermo Fisher Scientific15585011
SYBR Safe gel stainInvitrogenS33102
Gel extraction kitQiagen28706
PCR purification kit (Qiaquick)Qiagen28106
Vacuum system (Manifold)PromegaA7231
Nuclease-free microinjection buffer MilliporeMR-095-10F
Ultrafree-MC microcentrifuge filter MilliporeUFC30GV00
Cas9 mRNASigma-AldrichCAS9MRNA
CRISPR expressing plasmid (px330)Addgene42230
Nuclease free waterSigma-AldrichW4502
Phusion polymeraseNew England BiolabsM0530L
T7 Quick High Yield RNA kitNew England BiolabsE2050S
RNA purification spin columns (NucAway)Thermo Fisher ScientificAM10070
ssOligosSigma-AldrichOLIGO STANDARD
Donor plasmidThermo Fisher ScientificGeneArt
HyaluronidaseSigma-AldrichH3884
KSOMaa embryo culture mediumZenith Biotech ZEKS-100
Mineral oilZenith Biotech ZSCO-100
M2 MediumSigma-AldrichM7167
Cytochalasin BSigma-AldrichC6762
MouthpieceSigma-AldrichA5177
Glass microcapillariesSutter InstrumentBF100-78-10
Proteinase KApplichemA3830.0100
Dumont #5 forcepsFine Science Tools 91150-20
Iris scissorsFine Science Tools 91460-11
Vessel clampFine Science Tools 18374-43
Wound clips Fine Science Tools 12040-01
Clips applier Fine Science Tools 12018-12
Micro-scissors Fine Science Tools 15000-03
CauterizerFine Science Tools 18000-00
Non-absorbable surgical sutures (Ethilon 3-0)Ethicon1691H
5% CO2 incubatorMG ScientificGalaxy 14S
SpectrophotometerThermo Fisher ScientificNanodrop 2000c
ThermocyclerEppendorf6321 000.515
Electrophoresis set upBioRad1640300
UV TransilluminatorBioRad1708110EDU
ThermocyclerEppendorf6334000069
Stereoscopic microscopeOlympusSZX7
Inverted microscopeOlympusIX71
2x MicromanipulatorsEppendorf5188000.012
Oocytes manipulatorEppendorf5176000.025
Microinjector (Femtojet)Eppendorf5247000.013
Mice C57BL/6J strainAustralian BioResourcesC57BL/6JAusb 

Riferimenti

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