Geração de ratos geneticamente modificados através da microinjecção de oócitos

Resumo

A microinjecção de oócitos de rato é comumente utilizada tanto para a transgênese clássica ( ou seja, a integração aleatória de transgenes) e a segmentação de genes mediada por CRISPR. Este protocolo analisa os últimos desenvolvimentos em microinjeção, com ênfase particular no controle de qualidade e estratégias de genotipagem.

Resumo

O uso de camundongos geneticamente modificados tem contribuído significativamente para estudos em processos fisiológicos e patológicos in vivo . A injeção pronuclear de construções de expressão de DNA em oócitos fertilizados continua a ser a técnica mais utilizada para gerar camundongos transgênicos para superexpressão. Com a introdução da tecnologia CRISPR para segmentação gênica, a injeção pronuclear em oócitos fertilizados foi estendida à geração de camundongos knockout e knockin. Este trabalho descreve a preparação de DNA para injeção e a geração de guias CRISPR para segmentação gênica, com especial ênfase no controle de qualidade. Os procedimentos de genotipagem necessários para a identificação de potenciais fundadores são críticos. Estratégias inovadoras de genotipagem que aproveitam as capacidades de "multiplexação" do CRISPR são aqui apresentadas. Os procedimentos cirúrgicos também são delineados. Juntos, as etapas do protocolo permitirão a geração de genCamundongos eticamente modificados e para o estabelecimento subseqüente de colônias de ratos para uma infinidade de campos de pesquisa, incluindo imunologia, neurociência, câncer, fisiologia, desenvolvimento e outros.

Introdução

Os modelos animais, tanto em vertebrados quanto em invertebrados, têm sido fundamentais para examinar a fisiopatologia das condições humanas, como a doença de Alzheimer ^{1 , 2} . Eles também são ferramentas inestimáveis ​​para procurar modificadores de doenças e, em última instância, desenvolver novas estratégias de tratamento na esperança de uma cura. Embora cada modelo tenha limitações intrínsecas, o uso de animais como modelos sistêmicos inteiros é vital para a pesquisa biomédica. Isso ocorre porque o ambiente fisiológico metabólico e complexo não pode ser totalmente simulado na cultura de tecidos.

Até à data, o rato continua a ser a espécie de mamífero mais comum usada para manipulação genética porque apresenta várias vantagens. Os processos fisiológicos e os genes associados a doenças são altamente conservados entre camundongos e seres humanos. O mouse foi o primeiro mamífero a ter seu genoma completo seqüenciado (2002), um ano antes do geno humanoEu (2003). Além dessa riqueza de informações genéticas, o mouse possui boas capacidades de criação, um ciclo de desenvolvimento rápido (6 semanas desde a fertilização até o desmame) e um tamanho razoável. Todas essas vantagens, juntamente com indicadores fisiológicos, como cores de revestimento distintas (necessárias para estratégias de cruzamento), fizeram do mouse um modelo atraente para manipulação genética. Notavelmente, na era mais precoce da genética moderna, Gregor Mendel começou a trabalhar em camundongos antes de se mudar para as plantas ³ .

As técnicas de transferência de genes resultaram na geração do primeiro rato transgênico há mais de três décadas ⁴ , inicialmente criado usando a entrega viral. No entanto, os pesquisadores logo perceberam que um dos principais desafios da transgênese do mouse era a incapacidade de controlar o destino do DNA exógeno. Como a distribuição viral de transgenes em oócitos de ratos resultou em cópias múltiplas integradas aleatoriamente no genoma, o possibilitO estabelecimento de linhas transgênicas subsequentes foi limitado.

Uma dessas limitações foi superada quando Gordon et al. Gerou a primeira linha de mouse transgênica por microinjeção ^{5 , 6} . Isso começou a era da tecnologia de DNA recombinante, e os parâmetros que influenciam o resultado de uma sessão de microinjeção foram amplamente estudados ⁷ . Embora a microinjeção não permita o controle sobre o site de integração do transgene (que eventualmente resulta em níveis de expressão específicos para cada mouse fundador), a principal vantagem da microinjeção pronuclear continua sendo a formação de concatemers ( ou seja, matrizes de múltiplas cópias do transgene, Ligado em série) antes da integração genômica ⁵ . Esta característica tem sido utilizada ao longo dos anos para estabelecer milhares de linhas de mouse transgênicas que sobre-expressam um gene de interesse. Desde então, a transgênese, aModificação artificial do genoma de um organismo, tem sido amplamente utilizada para identificar o papel de genes únicos na ocorrência de doenças.

Uma outra conquista chave na manipulação do genoma do mouse foi alcançada quando o Mario Capecchi interrompeu com sucesso um único gene no mouse, abrindo a era da segmentação gênica ⁸ . No entanto, as principais desvantagens emergiram rapidamente da segmentação por células baseadas em células ES, incluindo os desafios de cultivar células ES, o grau de quimerismo um tanto variável e o comprimento do processo ( ou seja, 12-18 meses, mínimo, para obter o mouse) .

Recentemente, os avanços nas novas tecnologias, tais como endonucleases de engenharia ( por exemplo, nucleases de zinco (ZFN), efetoras nucleas efectoras de transcrição (TALEN), e repetições palindrômicas curtas (CRISPR / Cas9) agrupadas regularmente foram emergentes como métodos alternativos para Acelerar o processo de segmentação de genes no microfoneE ^{9 , 10} . Estas endonucleases podem ser facilmente injetadas em oócitos de ratinho por microinjeção, permitindo a geração de camundongos alvo de genes em apenas 6 semanas.

Desde o primeiro relatório sobre o uso do CRISPR para a edição do genoma ¹¹ , este sistema imunológico adaptativo bacteriano substituiu ZFN e TALEN por suas muitas vantagens, incluindo a facilidade de síntese e a capacidade de segmentar múltiplos loci de uma vez (referido como "multiplexação "). O CRISPR foi utilizado pela primeira vez para segmentação gênica em camundongos ¹² e desde então foi aplicado a inúmeras espécies, de plantas a seres humanos ^{13 , 14} . Até à data, não há relatório de uma única espécie resistente à edição do genoma CRISPR.

Os dois principais passos limitantes da geração de camundongos transgênicos são a injeção de oócitos eo reimplanteDesses oócitos em fêmeas pseudo-grávidas. Embora esta técnica tenha sido descrita por nós ¹⁵ e outros ¹⁶ , as melhorias técnicas recentes em embriologia de ratos e técnicas de transferência de genes revolucionaram o processo de geração de camundongos geneticamente modificados. Essas melhorias serão descritas aqui.

Protocolo

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética e Cuidados Animais da Universidade de Nova Gales do Sul.

1. Preparação do Transgene (Integração Aleatória)

1. Eletroforese analítica em gel de agarose.
   1. Digite o plasmídeo para acelerar o transgene usando enzimas apropriadas (incubação de 1 hora) ou enzimas de rápida digestão (15 a 30 min de incubação) em um termociclador seguindo as recomendações do fabricante (veja a Figura 2A e sua legenda).
   2. Juntar um gel de agarose de ácido tris-acetato-etilenodiaminotetraacetico a 1% (TEA), corado com 0,5-1,0 μg / mL de brometo de etidio (EtBr).
      NOTA: Tenha cuidado ao usar EtBr; É um mutagênico potente. Use o equipamento de proteção pessoal apropriado (consulte a folha de dados de segurança do material).
   3. Carregar um marcador de peso molecular de 1 kb.
   4. Carregue os fragmentos linearizados ( ie, transgene e espinha dorsal).
   5. Execute a eletroforese a 100 V por 45 min.
   6. Visualize o gel em um transiluminador ultravioleta (UV) para verificar se a digestão está completa e para confirmar o tamanho correto do transgene ( ou seja, 7,338 pb, veja a Figura 2A ).
2. Electroforese preparada em gel de agarose.
   1. Elimine um gel de agarose TAE a 1% corado com uma mancha de gel de baixa toxicidade. Carregar 8 alíquotas (1 μg cada) de transgene linearizado sem marcador de peso molecular e executar a eletroforese a 100 V durante 45 min. Use um bisturi para excluir todas as 8 bandas correspondentes ao transgene linearizado.
   2. Extraia o DNA usando um kit de extração de gel seguindo as recomendações do fabricante (veja a Tabela de Materiais ).
      1. Derreta os fragmentos de gel a 50 ° C em tubos de 1,5 mL durante pelo menos 15 min. Precipitar com isopropanol e depois adicionar o tampão de ligação.
      2. Combine todo o DNA, pipetando tudo em uma coluna. Eluir em tampão de microinjecção livre de nuclease (8 mM Tris-HCl e 0,15 mM EDTA). Filtrar através de um filtro de microcentrífuga de 0,22 μm e centrifugação por 60 s a 12 000 x g.
   3. Medir a concentração e a qualidade do DNA usando um espectrofotômetro. Verifique se a relação A260 / A280 é de cerca de 1,8 ( ou seja, nenhuma contaminação por proteínas) e a relação A260 / A230 é pelo menos 2,0 ( ou seja, não há contaminação por solventes orgânicos). Diluir até 3 ng / μL em tampão de microinjecção livre de nuclease, alíquota (20-50 μL) e congelar a -20 ° C.

2. Síntese de Componentes CRISPR (Gene Targeting)

1. Cas9 mRNA.
   1. Diluir o ARNm Cas9 (obtido a partir de uma fonte comercial, ver a Tabela de Materiais ) a uma concentração de 1 μg / μL em tampão de microinjeção livre de nucleases.
   2. Alíquota em 2 μL e livre Ze a -80 ° C.
2. RNA de guia único (SgRNA).
   1. Identifique as seqüências genômicas desejadas de dois lados (guias) utilizando uma ferramenta de projeto computacional que permita o potencial mínimo de atividade fora do alvo ¹⁷ .
      1. Para o knockout de genes, selecione sistematicamente duas guias localizadas a poucas centenas de pares de bases (pb) separadas, em direções opostas, e incluem o codão de início do gene de interesse. Para reparo direto de homologia, selecione duas guias sobrepostas (sempre que possível), em direções opostas.
         NOTA: Como exemplo, os seguintes guias foram recentemente co-injetados com sucesso para interromper o primeiro exão do gene TPM4.2 :
         Guia 1: 5 'CGCCATCCAGTTCGCGCTGC 3';
         Guia 2: 5 'CAGAACGATTGAGCTATGGC 3'
   2. Peça um conjunto de iniciadores conforme descrito na Tabela 1 .
   3. Sintetizar um modelo de DNA linear.
      1. Diluir px330Ref "> 12 plasmídeo a 10 ng / μL em água livre de nucleases.
      2. Prepare a mistura principal conforme indicado na Tabela 1 . Adicione a polimerase no final e mantenha a mistura principal no gelo.
      3. Misture e divida isso em 8 tubos de PCR (19 μL / tubo). Adicione 1 μL de px330 por tubo e execute o PCR nas seguintes condições: 1 min a 98 ° C; 40 ciclos de 98 ° C durante 10 s, 64 ° C durante 30 s e 72 ° C durante 15 s; E um alongamento final a 72 ° C durante 5 min. Segure a 4 ° C.
      4. Purifique os produtos de PCR usando um kit de purificação por PCR (veja a Tabela de Materiais ), um colector e uma fonte de vácuo (para um processamento mais rápido). Aplique a força máxima no vácuo ( ou seja, 8 mbar).
         1. Adicione 5 volumes (100 μL) de tampão de ligação a 1 volume da amostra de PCR e misture.
         2. Coloque uma coluna de rotação de membrana de sílica (fornecida) em um tubo de coleta (fornecido) de 2 mL para centrifugação ou no colector para processo de vácuoIng. Para ligar o DNA, aplique sucessivamente todas as 8 amostras à coluna e vácuo ou centrifugadora por 60 s a 12.000 xg por cada carga.
         3. Para lavar, adicione 0,75 mL de tampão de lavagem (PE tampão) à coluna e vácuo ou centrífuga por 60 s a 12.000 x g. Centrifugue a coluna por 60 s a 12.000 xg para eliminar o etanol residual.
         4. Coloque a coluna em um tubo de microcentrífuga limpo de 1,5 mL. Para eluir o DNA, adicione 30 μL de água livre de nuclease ao centro da membrana, deixe a coluna repousar durante 1 min e centrifugue por 60 s a 12 000 g.
      5. Medir a concentração usando um espectrofotômetro; Tipicamente, a concentração deve ser 100 ng / μL ou superior. Verifique se a relação A260 / A280 é de cerca de 1,8 ( ou seja, nenhuma contaminação por proteínas) e a relação A260 / A230 é pelo menos 2,0 ( ou seja, não há contaminação por solventes orgânicos).
   4. Transcrição in vitro usando um kit de síntese de RNA T7.
      1. Prepare tEle mestre mistura, como indicado na Tabela 1 , e incuba durante 3 h a 37 ° C num termociclador. Adicione 28 μL de água livre de nuclease e 2 μL de DNase I e incube durante mais 15 min a 37 ° C num termociclador.
   5. Purificação de ARN usando colunas de rotação.
      1. Dissolver o pó contido na coluna de rotação fornecida em 650 μL de tampão de microinjeção livre de nuclease, removendo cuidadosamente todas as bolhas de ar. Capte o tubo e hidrata durante 5 a 15 min à temperatura ambiente.
      2. Remova a tampa azul na parte inferior e coloque a coluna em um tubo de 2 mL. Centrifugar durante 2 min a 750 xg e temperatura ambiente. Coloque a coluna em um tubo fresco de 1,5 mL e aplique gota a gota 50 μL da solução de ARN no centro, sem tocar na parede da coluna. Gire a coluna durante 2 min a 750 x g.
      3. Medir a concentração de ARN usando um espectrofotômetro (o rendimento típico de uma reação é de 30 a 50 μg). Verifique se a relação A260 / A280 é umaA ronda 2.0 ( ou seja, nenhuma contaminação por proteínas) ea relação A260 / A230 é de pelo menos 2,0 ( ou seja, não há contaminação por solventes orgânicos). Armazene os sgRNAs em -80 ° C até o uso.
      4. Avalie a qualidade do RNA usando os géis de TAE de 1% rotineiramente utilizados para a eletroforese de DNA. Execute 200-400 ng do modelo de DNA e o sgRNA correspondente em paralelo. A banda de RNA (≈ 100 pb) deve ser ligeiramente maior que a banda de DNA (ver Figura 3A ).

3. Modelo do doador

1. Peça oligonucleótidos de cadeia simples sintetizados comercialmente (ssOligos, veja a Tabela de Materiais ) para mutações pontuais ou para a integração de pequenas sequências até 50 pb; Os braços de homologia são normalmente de 60 a 90 pb de comprimento.
2. Para inserções maiores, use um plasmídeo doador como modelo. Gerar um plasmídeo adequado usando o método clássico de clonagem ou síntese de novo a partir de umFonte comercial.
   NOTA: Recomenda-se um mínimo de 800 pb por braço de homologia. O tamanho da espinha dorsal não tem influência na eficiência do reparo direto de homologia (HDR).

4. Mistura por injeção

1. Diluir o ARNm de Cas9 a 50 ng / μL e os sgRNAs para 12,5 ng / μL (25 ng / μL no total) usando tampão de microinjeção livre de nucleases para experiências de nocaute de genes. Adicione o modelo de doador (ssOligo ou plasmídeo) a uma concentração de 200 ng / μL para experiências de edição de genoma com base em reparo direto de homologia.
   NOTA: Os volumes de diluição podem ser facilmente determinados usando ferramentas on-line, como uma calculadora de ressuspensão ¹⁸ .
2. Mantenha cada alíquota no gelo durante a sessão de microinjeção e descarte depois (não re-congelar a mistura de injeção).

5. Vasectomia Scrotal

NOTA: Dois tipos de vasectomia são comumente realizados em camundongos: abdominal e escrotal. O últimoÉ menos invasivo e já foi descrito anteriormente ¹⁵ .

1. Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos de aço inoxidável.
2. Determine o peso do mouse usando uma escala de pesagem e anestesize os machos por injeção intraperitoneal (ip) com anestésicos injetáveis ​​(ketamina 100 mg / kg, xilazina 10 mg / kg).
3. Monitore a perda do reflexo de pitada do dedo do pé e, uma vez que o mouse é sedado, coloque-o sobre uma almofada de aquecimento.
4. Desinfecte a pele em torno dos testículos com toalhetes alternados de um anti-séptico tópico, como a clorhexidina e 70% de etanol.
5. Empurre os testículos no saco escrotal e faça uma incisão da pele com um bisturi.
6. Visualize o testículo, a cauda epidídima e o canal deferente.
7. Pegue o canal deferente com fórceps, segure-o e cauterize em cada lado da pinça para remover 3 mm do canal deferente.
8. Execute o mesmo procedimento no segundo testículo.
9. Feche as incisões da pele com clipes de ferida e monitore aMouse de perto até recuperação completa.

6. Superovulação (Doadores de Oócitos) e Time-Mating (Fêmeas Pseudo-grávidas)

NOTA: A técnica para gerar um número adequado de oócitos fertilizados e fêmeas adotivas obstruídas para reimplante foi descrita em outro lugar ¹⁵ .

1. Injectar 10 fêmeas ip com 5 UI de gonadotrofina sérica da égua grávida (PMSG em 100 μL) em torno de 12 horas no dia 1.
2. Injete as fêmeas ip com 5 UI de gonadotrofina coriônica humana (hCG em 100 μL) 46-48 h depois (cerca de 11 horas no dia 3).
3. Imediatamente mate as fêmeas com machos solteiros durante a noite.

7. Injeções Pronucleares (de integração aleatória) e citoplasmáticas (Gene-targeting)

1. Retire os camundongos superovulados por deslocamento cervical, exponha o abdômen e acesse os ovários e ovidutos, conforme descrito anteriormente ¹⁵ . Dissecte o oViducos e colhe os complexos cumulus-oócitos (COCs) sob um estereomicorscópio ¹⁵ . Coloque-os em uma gota de meio de otimização de potássio simplex suplementado com aminoácidos (KSOMaa) seguindo o método tradicional ¹⁵ .
2. Purifique os oócitos adicionando aproximadamente 1 μL de hialuronidase (10 mg / mL) à gota do meio de KSOMaa usando uma bocal de aspirador e coloque o prato em uma incubadora de CO _{2 de} 37 ° C / 5% durante 30 s a 1 min.
3. Lave os oócitos com 4 gotas frescas de meio KSOMaa usando a boca da aspiradora e transfira-as para uma gota final de meio KSOMaa sobreposta com óleo mineral (cerca de 2 mL). Coloque o prato na incubadora de CO _{2 de} 37 ° C / 5% até que os oócitos estejam prontos para injeção.
4. Injeção pronuclear (integração aleatória).
   1. Visualize os ovos sob o microscópio estereoscópico e transfira aproximadamente 50 ovos para a câmara de injeção (uma droP de meio M2 coberto com óleo mineral) usando a peça de boca do aspirador.
   2. Transfira a câmara de injeção para o microscópio invertido e injete os oócitos fertilizados (dois pronúcleos visíveis) com alguns picolitros da mistura de injeção, visando um pronúcleo (qualquer dos pronúcleos pode ser direcionado). Visualize uma injeção bem sucedida observando o inchaço do pronúcleo.
5. Injeção citoplasmática (segmentação gênica).
   1. Transfira aproximadamente 50 ovos para uma gota de KSOMaa contendo 5 μg / mL de Citotinase B utilizando a peça bucal e incubar durante 5 min na incubadora a 37 ° C / 5% de CO ₂ .
   2. Transfira os ovos para a câmara de injeção usando a peça da boca.
   3. Injetar poucos picolitros da mistura de injeção no citoplasma a uma pressão muito baixa (50-100 hPa), usando a pressão de compensação do microinjetor automatizado sempre que possível.
   4. Após a injeção, transfira os oócitos de volta para uma gota de KSOMaa (usando a peça de boca) e mantê-los na incubadora de CO _{2 de} 37 ° C / 5%, até serem carregados para reimplante no oviduto de fêmeas pseudo-grávidas.

8. Reimplante

1. Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos de aço inoxidável.
2. Determine o peso do mouse usando a escala de pesagem e anestesize as fêmeas por injeção intraperitoneal (ip) com anestésicos injetáveis ​​(ketamina 100 mg / kg, xilazina 10 mg / kg).
3. Monitore a perda do reflexo de pitada do dedo do pé e, uma vez que o mouse é sedado, coloque-o sobre uma almofada de aquecimento.
4. Inclua uma grande área da pele ao redor da linha média dorsal do mouse feminino.
5. Desinfecte a pele exposta com toalhetes alternados de um anti-séptico tópico, como a clorhexidina e 70% de etanol.
6. Exponha o trato reprodutivo seguindo o método tradicional ¹⁵ . Faça uma incisão de pele de 1 cm de comprimento paralela à linha média dorsal, corte o músculo e pegue a almofada de gordura.Uma pinça, depois puxe suavemente o ovário até que o seu oviducto e o útero sejam claramente visíveis.
7. Corrija a almofada gorda com um grampo de vaso. Visualize o oviduto sob o microscópio estereoscópico e usando um par de micro-tesouras faça uma incisão na parede do oviducto alguns milímetros a montante da ampola.
8. Sob o microscópio estereoscópico, carregue 25 ovos microinjetados no capilar de vidro conectado à boca (o diâmetro interno do capilar deve ter cerca de 120 um de largura). Introduza o capilar de vidro no tubo de ovidação e expulse até que uma bolha de ar seja visível dentro da ampola.
9. Remova cuidadosamente o capilar de vidro e coloque o trato reprodutivo no abdômen. Suturar a incisão com suturas cirúrgicas não absorvíveis 3-0, depois fechar com clipes de ferida. Monitore o mouse de perto até recuperar completamente.

9. Estratégias de Genotipagem / Seqüenciamento

NOTA: Isolar o genômicoDNA de biópsias de cauda ou orelha de 2 mm, seguindo os regulamentos relevantes de ética animal.

1. Extração rápida de DNA genômico (integração aleatória).
   1. Leve as amostras de tecido (~ 2 mm) a 95 ° C durante 1 h em 100 μL de reagente de lise alcalino (hidróxido de sódio 25 mM e EDTA 0,2 mM, pH = 12).
   2. Adicionar 100 μL de reagente neutralizante (Tris-HCl 40 mM, pH = 5).
   3. Centrifugar durante 5 minutos a 12.000 g e 4 ° C.
2. Extração de DNA genômico de alta qualidade (segmentação de genes).
   1. Adicionar 500 μL de tampão de cauda (Tris 50 mM, pH = 8, EDTA 100 mM, pH = 8; NaCl 100 mM, SDS a 1% e 0,5% de proteinasa K, adicionada recentemente).
   2. Incubar durante a noite a 55 ° C.
   3. Misture por 5 minutos com a inversão (não vortex).
   4. Adicione 250 μL de NaCl saturado (6 M) e misture durante 5 minutos invadindo (não vortex).
   5. Girar por 5-10 min a 12.000 xg e 4 ° C e despeje o sobrenadante para o novo tubo.
   6. Adicione 500 μL de isopropanol e misture por 5 minutos com inversão (não vortex).
   7. Gire durante 10 minutos a 12.000 xg e temperatura ambiente.
   8. Decantar o sobrenadante (o pellet é invisível e fica com o tubo).
   9. Lavar com 1 mL de etanol a 70%.
   10. Rotação por 5-10 min a 12.000 xg e temperatura ambiente. Remova o sobrenadante com cuidado, já que o sedimento branco não é mais pegajoso e pode ser perdido.
   11. Seque o ar por ~ 1 h.
   12. Adicionar 400 μL de tampão TE (Tris 10 mM e EDTA 1 mM, pH = 8).
   13. Dissolver o DNA a 55-60 ° C durante 2 h.
3. Desenho inicial.
   1. Desenhe primers com um mínimo de 20 pb de comprimento usando uma ferramenta computacional ¹⁹ .
      NOTA: Para a integração aleatória, os primers devem se hibridizar com o transgene, gerando um fragmento distinto de 200-800 pb. Para a segmentação por genes, crie os primers para que eles hibridem com o DNA genômico, gerando um f distintoAumentando algumas centenas de bp em torno dos locais cortados. Para inserções grandes, os iniciadores podem se sentar no transgene, mas a confirmação da integração direcionada deve ser realizada subsequentemente usando uma caminhada de iniciador ou uma técnica similar.
4. Genotipagem por PCR.
   1. Para cada modificação genômica, crie um novo protocolo de PCR e teste-o empiricamente. Considere o comprimento do fragmento gerado e a temperatura de fusão (Tm) de cada par de primers.
5. Seqüenciamento.
   1. Para a segmentação por genes, envie produtos de PCR para um provedor de serviços de seqüestro Sanger.

Resultados

Abaixo, descrevem-se os fluxos de trabalho para microinjecção no caso de integração aleatória e orientação de genes mediada por CRISPR ( Figura 1 ).

Figura 1: Fluxo de trabalho típico para a geração de ratos modificados genéticamente. Para a integração aleatória, o transgene pur...

Discussão

Passos críticos dentro do protocolo

A geração de camundongos geneticamente modificados é conhecida por ser tecnicamente desafiadora. No entanto, o protocolo apresentado aqui é um método otimizado e simplificado que permite dominar e solucionar a técnica em tempo recorde. Há duas etapas necessárias para a conclusão bem-sucedida da técnica. Primeiro, a síntese de modelos de DNA linear (para a síntese de sgRNAs) pode ser conseguida sem cloreto de magnésio (MgCl2). No entanto, é alta...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micropipette 0.1-2.5 ul	Eppendorf	4920000016
Micropipette 2-20 ul	Eppendorf	4920000040
Micropipette 20-200 ul	Eppendorf	4920000067
Micropipette 100-1000 ul	Eppendorf	4920000083
Molecular weight marker	Bioline	BIO-33025	HyperLadder 1kb
Molecular weight marker	Bioline	BIO-33056	HyperLadder 100 bp
Agarose	Bioline	BIO-41025
EDTA buffer	Sigma-Aldrich	93296	10x - Dilute to 1x
Ethidium bromide	Thermo Fisher Scientific	15585011
SYBR Safe gel stain	Invitrogen	S33102
Gel extraction kit	Qiagen	28706
PCR purification kit (Qiaquick)	Qiagen	28106
Vacuum system (Manifold)	Promega	A7231
Nuclease-free microinjection buffer	Millipore	MR-095-10F
Ultrafree-MC microcentrifuge filter	Millipore	UFC30GV00
Cas9 mRNA	Sigma-Aldrich	CAS9MRNA
CRISPR expressing plasmid (px330)	Addgene	42230
Nuclease free water	Sigma-Aldrich	W4502
Phusion polymerase	New England Biolabs	M0530L
T7 Quick High Yield RNA kit	New England Biolabs	E2050S
RNA purification spin columns (NucAway)	Thermo Fisher Scientific	AM10070
ssOligos	Sigma-Aldrich	OLIGO STANDARD
Donor plasmid	Thermo Fisher Scientific	GeneArt
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3884
KSOMaa embryo culture medium	Zenith Biotech	ZEKS-100
Mineral oil	Zenith Biotech	ZSCO-100
M2 Medium	Sigma-Aldrich	M7167
Cytochalasin B	Sigma-Aldrich	C6762
Mouthpiece	Sigma-Aldrich	A5177
Glass microcapillaries	Sutter Instrument	BF100-78-10
Proteinase K	Applichem	A3830.0100
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	91150-20
Iris scissors	Fine Science Tools	91460-11
Vessel clamp	Fine Science Tools	18374-43
Wound clips	Fine Science Tools	12040-01
Clips applier	Fine Science Tools	12018-12
Micro-scissors	Fine Science Tools	15000-03
Cauterizer	Fine Science Tools	18000-00
Non-absorbable surgical sutures (Ethilon 3-0)	Ethicon	1691H
5% CO2 incubator	MG Scientific	Galaxy 14S
Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	Nanodrop 2000c
Thermocycler	Eppendorf	6321 000.515
Electrophoresis set up	BioRad	1640300
UV Transilluminator	BioRad	1708110EDU
Thermocycler	Eppendorf	6334000069
Stereoscopic microscope	Olympus	SZX7
Inverted microscope	Olympus	IX71
2x Micromanipulators	Eppendorf	5188000.012
Oocytes manipulator	Eppendorf	5176000.025
Microinjector (Femtojet)	Eppendorf	5247000.013
Mice C57BL/6J strain	Australian BioResources	C57BL/6JAusb