난 모세포의 미세 주입을 통한 유전자 조작 마우스의 생성

요약

마우스 oocytes의 microinjection는 일반적인 transgenesis ( 즉, transgenes의 무작위 통합) 및 CRISPR 매개 유전자 타겟팅 모두에 일반적으로 사용됩니다. 이 프로토콜은 품질 관리 및 유전자 타이핑 전략에 중점을두고 마이크로 인젝션의 최신 개발 상황을 검토합니다.

초록

유전자 조작 마우스의 사용은 생체 내 및 병리학 적 생체 내 과정 모두에 대한 연구에 크게 기여했다. 수정 된 난 모세포 내로의 DNA 발현 구조물의 전 핵 주입은 과발현을위한 형질 전환 쥐를 생성하는 가장 보편적 인 기술로 남아있다. 유전자 표적화를위한 CRISPR 기술이 도입됨에 따라 수정 된 난 모세포에 전핵을 주입하여 knockout과 knockin 마우스를 생성 할 수있게되었다. 이 연구는 유전자 타겟팅을위한 사출 용 DNA의 준비와 CRISPR 가이드의 생성을 기술하고 있으며 특히 품질 관리에 중점을두고 있습니다. 잠재적 인 창시자를 확인하는 데 필요한 유전형 분석 절차가 중요합니다. CRISPR의 "멀티플렉싱"기능을 활용하는 혁신적인 유전자형 전략이 여기에 제시됩니다. 수술 절차도 요약되어 있습니다. 함께, 프로토콜의 단계는 세대의 생성을 허용합니다면역학, 신경 과학, 암, 생리학, 발달 및 기타를 포함한 수많은 연구 분야에서 마우스 식민지를 확립하는 데 사용됩니다.

서문

척추 동물과 무척추 동물의 동물 모델은 알츠하이머 병과 같은 인간의 병태 생리학을 검사하는 도구가되어왔다. 그들은 질병 치료제를 찾고 궁극적으로 완치를위한 새로운 치료 전략을 개발할 수있는 귀중한 도구이기도합니다. 각 모델에는 본질적인 한계가 있지만, 전신 모델로 동물을 사용하는 것은 생물 의학 연구에 필수적입니다. 이것은 신진 대사와 복잡한 생리 환경이 조직 배양에서 완전히 모의 될 수 없기 때문입니다.

지금까지 마우스는 유전자 조작에 사용되는 가장 일반적인 포유류 종으로 남아 있기 때문에 몇 가지 장점이 있습니다. 질병과 관련된 생리적 과정과 유전자는 생쥐와 인간 사이에서 매우 잘 보존되어 있습니다. 마우스는 인간 게놈보다 일년 전에 (2002 년) 전체 유전체 염기 서열을 갖는 최초의 포유 동물이었다.나 (2003). 이 풍부한 유전자 정보 외에, 번식 능력이 좋고 발달주기가 빠르며 (수정으로부터 이유식까지 6 주) 적당한 크기입니다. 뚜렷한 외투 색상 (교차 전략에 필요)과 같은 생리적 인 지표와 결합 된 이러한 모든 장점은 마우스를 유전자 조작을위한 매력적인 모델로 만들었습니다. 주목할 만하게, 현대 유전학의 아주 이른 나이에서는, Gregor Mendel는 식물 ^3으로 움직이기 전에 쥐에 종사 시작했다.

유전자 전달 기술은 바이러스 성 전달을 이용하여 처음 생성 된 30 년 전의 첫 번째 형질 전환 마우스의 생성을 가져왔다. 그러나 연구자들은 곧 마우스 전이의 주요 과제 중 하나가 외인성 DNA의 운명을 제어 할 수 없다는 것을 깨달았습니다. 마우스 난 모세포로 형질 전환 유전자를 바이러스로 전달하면 게놈에 무작위로 여러 복제물이 통합되기 때문에,후속 형질 전환 계통을 확립하는 것이 제한적이었다.

이러한 한계 중 하나는 Gordon et al. microinjection ^{5 , 6} 에 의한 최초의 형질 전환 마우스 라인을 생성했다. 이것은 재조합 DNA 기술의 시대를 열었고 마이크로 인젝션 세션의 결과에 영향을 미치는 매개 변수가 널리 연구되었습니다 ⁷ . 마이크로 인젝션 (microinjection)은 형질 도입 유전자의 통합 부위에 대한 제어를 허용하지 않지만 (결과적으로 각 창 마우스에 대한 특이적인 발현 수준을 유도 함), 전 핵 마이크로 인젝션의 주요 이점은 컨 테이너 (concatemer)의 형성이다 ( 즉 , 게놈 통합 이전에 시리즈로 링크 됨) ⁵ . 이러한 특성은 수년 동안 관심있는 유전자를 과발현하는 수천 개의 트랜스 제닉 마우스 라인을 수립하는데 사용되었습니다. 그 이후로 유전자 변형,유기체 게놈의 인공 수정은 질병 발생시 단일 유전자의 역할을 확인하는 데 광범위하게 사용되었습니다.

마리오 카 페치 (Mario Capecchi)가 생쥐의 단일 유전자를 성공적으로 파괴하여 유전자 표적화 시대를 열었을 때 마우스 게놈을 조작하는 데있어 중요한 성과를 달성했습니다. 그러나 ES 세포 배양의 어려움, 약간의 가변성의 키메라 (chimerism) 정도, 과정의 길이 ( 즉, 마우스를 얻는 데 최소 12-18 개월)를 비롯하여 ES 세포 기반 유전자 표적화에서 주요 단점이 빠르게 나타났다. .

최근에, ZFN, TALEN 및 CISPR / Cas9와 같은 신기술의 진보가 대체 방법으로 등장했다. 마이크에서 유전자 타겟팅 과정을 가속화한다.e ^{9 , 10} . 이 endonucleases는 microinjection에 의해 마우스 난 모세포에 쉽게 주입 될 수 있으며, 6 주 이내에 유전자 표적 마우스를 생성 할 수 있습니다.

게놈 편집을위한 CRISPR 사용에 관한 첫 번째 보고서 이후이 박테리아 적응 면역 시스템은 ZFN과 TALEN을 대체했으며 그 이유는 합성의 용이함과 동시에 여러 유전자좌를 표적으로하는 능력 ( "멀티플렉싱 "). CRISPR은 생쥐 ¹² 번에서 유전자 타겟팅에 처음 사용되었으며 이후 식물에서 사람 ^13,14 로 무수한 종에 적용되었습니다. 현재까지 CRISPR 게놈 편집에 저항하는 단일 종에 대한보고는 없다.

유전자 변형 생쥐의 생성의 두 가지 주요 제한 단계는 난 모세포의 주입과 재 이식이 난 모세포를 가짜 임신 한 암컷으로 이 기술은 우리와 ¹⁵ 에 의해 기술되었지만 최근의 쥐 발생학 및 유전자 전달 기술의 기술적 향상은 유 전적으로 변형 된 쥐를 생성하는 과정에 혁명을 일으켰습니다. 이러한 개선 사항은 여기에 설명됩니다.

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프로토콜

모든 절차는 뉴 사우스 웨일즈 동물 보호 및 윤리위원회의 승인을 받았습니다.

1. Transgene의 준비 (Random Integration)

1. 분석 아가 로스 겔 전기 영동.
   1. 제조자의 권고 사항을 따르는 thermocycler에서 적절한 효소 (1 시간 배양) 또는 빠른 분해 효소 (15 ~ 30 분 배양)를 사용하여 도입 유전자를 제거하기 위해 플라스미드를 분해하십시오 ( 그림 2A 및 그 전설 참조).
   2. 0.5 ~ 1.0 μg / ML ethidium bromide (EtBr)로 염색 한 1 % 트리스 - 아세테이트 - 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) (TEA) 아가로 오스 겔을 주조합니다.
      참고 : EtBr을 사용할 때는주의하십시오. 그것은 유력한 돌연변이 원입니다. 적절한 개인 보호 장비를 사용하십시오 (물질 안전 보건 자료 참조).
   3. 1 kb 분자량 마커를로드하십시오.
   4. 선형화 된 조각 ( 즉, 도입 유전자 및 백본)을로드하십시오.
   5. 전기 영동을 100V에서 45 분 동안 실행합니다.
   6. 자외선 (UV) 투과 조명기에서 젤을 시각화하여 소화가 완료되었는지 확인하고 트랜스 진 ( 즉, 7,338 bp, 그림 2A 참조 )의 정확한 크기를 확인하십시오.
2. 준비 아가로 오스 겔 전기 영동.
   1. 저독성 젤 얼룩으로 염색 된 1 % TAE 아가 로즈 겔을 주조하십시오. 분자량 마커가없는 직선화 된 도입 유전자 8 개 (각 1 μg)를 넣고 45 분 동안 100 V에서 전기 영동하십시오. 선형화 된 도입 유전자에 해당하는 8 개의 모든 밴드를 제거하려면 메스를 사용하십시오.
   2. 제조사의 권고 사항에 따라 젤 추출 키트를 사용하여 DNA를 추출합니다 ( 재료 표 참조).
      1. 적어도 15 분 동안 1.5 ML 튜브 50 ° C에서 겔 조각을 녹여. 이소프로판올로 침전시킨 다음 결합 버퍼를 첨가하십시오.
      2. 전체 D 조 합치기모든 것을 하나의 컬럼으로 피펫 팅하여 NA. 뉴 클레아제가없는 마이크로 인젝션 완충액 (8 mM Tris-HCl 및 0.15 mM EDTA)으로 용출시킨다. 0.22 μm의 미세 원심 분리 필터를 거쳐 12,000 x g에서 60 초 동안 원심 분리하십시오.
   3. 분광 광도계를 사용하여 DNA의 농도와 품질을 측정하십시오. A260 / A280 비율이 1.8 ( 즉, 단백질에 의한 오염 없음)이고 A260 / A230 비율이 2.0 이상 ( 즉, 유기 용제에 의한 오염 없음)인지 점검하십시오. nuclease-free 마이크로 인젝션 버퍼, 분액 (20-50 μL)에서 3 ng / μL로 희석하고 -20 ° C에서 동결하십시오.

2. CRISPR 성분의 합성 (유전자 표적화)

1. Cas9 mRNA.
   1. nuclease-free 마이크로 인젝션 버퍼에 1 μg / μL의 농도로 Cas9 mRNA (상업용 소스에서 얻음, Table of Materials 참조)를 희석 하십시오.
   2. 2 μL 및 무료로 나누어지는 -80 ° C에서하십시오.
2. 단일 가이드 RNA (SgRNA).
   1. 최소한의 잠재적 인 목표 외 활동을 허용하는 컴퓨터 설계 도구를 사용하여 원하는 두 표적 게놈 서열 (지침)을 확인하십시오.
      1. 유전자 녹아웃의 경우, 반대 방향으로 수백 개의 염기쌍 (bp) 떨어져있는 두 개의 가이드를 체계적으로 선택하고 관심 유전자의 시작 코돈을 포함시킵니다. 상 동성 직접 수리의 경우, 가능한 한 두 개의 중첩 가이드를 반대 방향으로 선택하십시오.
         참고 : 예를 들어, 다음 안내서는 최근 TPM4.2 유전자의 첫 번째 엑손을 파괴하기 위해 성공적으로 공동 주입되었습니다 :
         가이드 1 : 5 'CGCCATCCAGTTCGCGCTGC 3';
         가이드 2 : 5 'CAGAACGATTGAGCTATGGC 3'
   2. 표 1 에 설명 된대로 프라이머 세트를 주문하십시오.
   3. 선형 DNA 템플릿을 합성합니다.
      1. 희석 px330Nuclease-free water에서 10 ng / μL까지 플라스미드를 교체하십시오.
      2. 표 1 에 표시된대로 마스터 믹스를 준비합니다. 마지막에 폴리머 라제를 첨가하고 마스터 믹스를 얼음에 보관하십시오.
      3. 이를 8 개의 PCR 튜브 (19 μL / 튜브)로 나누고 나누십시오. 튜브당 px330 1 μL를 추가하고 다음 조건에서 PCR을 실행하십시오 : 98 ° C에서 1 분; 98 ℃에서 10 초, 64 ℃에서 30 초, 72 ℃에서 15 초의 40주기; 및 72 ℃에서 5 분 동안의 최종 신도. 4 ° C에서 유지.
      4. PCR 정제 키트 (물질 표 참조), 다기관 및 진공 원 (빠른 처리를 위해)을 사용하여 PCR 생성물을 정제하십시오. 최대 진공 강도 ( 예 : 8 mbar)를가하십시오.
         1. PCR 샘플 1 볼륨에 결합 버퍼의 5 볼륨 (100 μL)을 추가하고 섞는다.
         2. 원심 분리를 위해 2-mL 수집 튜브 (제공) 또는 진공 공정을위한 매니 폴드에 (제공 한) 실리카 멤브레인 스핀 컬럼을 놓습니다ing. DNA를 바인딩하려면 8 개의 시료를 모두 컬럼에 연속적으로 넣고 60 초 동안 진공 또는 12,000 xg로 원심 분리합니다.
         3. 세척을 위해 0.75 mL의 세척 완충액 (완충액 PE)을 컬럼에 넣고 12,000 x g에서 60 초 동안 진공 또는 원심 분리한다. 잔류 에탄올을 제거하기 위해 12,000 xg에서 60 초 동안 컬럼을 원심 분리하십시오.
         4. 컬럼을 깨끗한 1.5 mL 미세 원심 분리 튜브에 넣으십시오. DNA를 용리시키기 위해 멤브레인의 중심에 30 μl의 nuclease가없는 물을 넣고 컬럼을 1 분 동안 방치 한 다음 12,000 g에서 60 초 동안 원심 분리하십시오.
      5. 분광 광도계를 사용하여 농도를 측정하십시오. 일반적으로 농도는 100 ng / μL 이상이어야합니다. A260 / A280 비율이 1.8 ( 즉, 단백질에 의한 오염 없음)이고 A260 / A230 비율이 2.0 이상 ( 즉, 유기 용제에 의한 오염 없음)인지 점검하십시오.
   4. T7 RNA 합성 키트를 이용한 시험관 전사.
      1. 준비하기그는 표 1 에 표시된대로 마스터 믹스하고 thermocycler에서 37 ° C에서 3 시간 품어. nuclease-free 물 28 μL와 DNase I 2 μL를 넣고 37 ℃에서 15 분 더 incubate하십시오.
   5. 스핀 컬럼을 이용한 RNA 정제.
      1. 제공된 스핀 컬럼에 담긴 파우더를 nuclease-free microinjection buffer 650 μL에 녹여 모든 기포를 조심스럽게 제거합니다. 튜브에 뚜껑을 덮고 실온에서 5-15 분 동안 수화시킵니다.
      2. 하단의 파란색 캡을 제거하고 컬럼을 2 mL 튜브에 넣으십시오. 750 XG 및 실온에서 2 분 동안 원심 분리기. 칼럼을 새로운 1.5-mL 튜브에 넣고 칼럼 벽을 건드리지 않고 50㎕의 RNA 용액을 가운데에 적가한다. 칼럼을 750 x g에서 2 분간 돌린다.
      3. 분광 광도계를 사용하여 RNA 농도를 측정하십시오 (한 반응의 일반적인 수율은 30 - 50 μg입니다). A260 / A280 비율이2.0 ( 즉, 단백질에 의한 오염이 없음)이고 A260 / A230 비는 2.0 이상 ( 즉, 유기 용제에 의한 오염 없음)이다. 사용하기 전까지 -80 ° C에서 sgRNA를 보관하십시오.
      4. DNA 전기 영동을 위해 일상적으로 사용되는 1 % TAE 젤을 사용하여 RNA의 품질을 평가하십시오. 200-400 ng의 DNA 주형과 해당 sgRNA를 동시에 실행하십시오. RNA 밴드 (≈ 100 bp)는 DNA 밴드보다 약간 커야합니다 ( 그림 3A 참조 ).

3. 기증자 템플릿

1. 점 돌연변이 또는 50bp 이하의 작은 서열의 통합을 위해 상업적으로 합성 된 1 본쇄 올리고 뉴클레오티드 (ssOligos, 표 2 참조)를 주문하십시오. 상 동성 암은 전형적으로 60-90 bp이다.
2. 더 큰 삽입을 위해, 기증자 플라스미드를 주형으로 사용하십시오. 고전적인 클로닝 방법을 사용하여 적절한 플라스미드를 생성하거나상업적 출처.
   참고 : 상 동성 암당 최소 800 bp를 권장합니다. 백본의 크기는 상 동성 직접 수선 (HDR)의 효율성에 영향을 미치지 않습니다.

4. 사출 성형

1. 유전자 녹아웃 실험을 위해 nuclease-free microinjection buffer를 사용하여 Cas9 mRNA를 50 ng / μL로 희석하고 sgRNA를 12.5 ng / μL (총 25 ng / μL)로 희석한다. 상 동성 직접 수리를 기반으로 게놈 편집 실험 200 ng / μL의 농도에서 기증자 템플릿 (ssOligo 또는 플라스미드)를 추가합니다.
   참고 : 희석액은 재 계산기 ¹⁸ 과 같은 온라인 도구를 사용하여 쉽게 결정할 수 있습니다.
2. microinjection 세션 동안 얼음에 각 나누어지는 유지하고 나중에 폐기 (주입 믹스를 다시 동결하지 마십시오).

5. 음낭 정관 절제술

참고 : 두 종류의 정관 수술은 일반적으로 생쥐에서 수행됩니다 : 복부 및 음낭. 후자의덜 침략적이며 이전에 설명되었습니다 ¹⁵ .

1. 모든 스테인레스 스틸 수술기구를 고압 증기 멸균하십시오.
2. 체중계를 사용하여 마우스의 무게를 결정하고 주사 마비 (케타민 100 MG / kg, xylazine 10 MG / kg)와 intraperitoneal (IP) 주사하여 남성을 마취.
3. 발가락 핀치 반사의 손실을 모니터하고 마우스가 진정되면 발열 패드 위에 올려 놓습니다.
4. 클로르헥시딘과 70 % 에탄올과 같은 국소 소독제를 번갈아 사용하여 고환 주위의 피부를 소독합니다.
5. 고환을 음낭 안으로 밀어 넣고 메스로 피부 절개를하십시오.
6. testis, cauda epididymis 및 vas deferens를 시각화하십시오.
7. 집게로 유리관을 잡고, 잡고, 집게의 3mm를 제거하기 위해 집게 양쪽을 소성합니다.
8. 두 번째 testis에 동일한 절차를 수행하십시오.
9. 상처 클립으로 피부 절개 부를 닫고완전히 회복 될 때까지 마우스를 가까이서 누릅니다.

6. Superovulation (난자 기증자)과 Time-mating (의사 임신 한 여성)

주 : 적절한 수의 수정 된 난 모세포를 생성하고 재 이식을 위해 위탁 암컷을 막는 기술은 다른 곳에서 기술되어있다.

1. 1 일 12 시경 약 5 IU의 임산부의 혈청 생식샘 자극 호르몬 (PMSG; 100 μL)을 10 명의 여성에게 투여한다.
2. 46 ~ 48 시간 후 (3 일 오전 11 시경) 5 IU의 인간 chorionic 성선 자극 호르몬 (hCG, 100 μL)을 투여합니다.
3. 하룻밤 사이에 한 마리의 수컷 남성과 암컷을 즉시 교배하십시오.

7. 전핵 (무작위 통합)과 세포질 (유전자 타겟팅) 주사

1. 이전에 설명한 바와 같이, 자궁 경부 탈구로 과식 배란 된 마우스를 뽑아 내고, 복부를 노출시키고, 난소와 난관에 접근하십시오. 오해입체 시야 (stereomicorscope)하에 적운 - 난 모세포 복합체 (cumulus-oocyte-complexes, COCs)를 수확합니다. 전통적인 방법 ^15에 따라 아미노산 (KSOMaa)가 보충 된 칼륨 심플 렉스 최적화 배지 1 방울에 넣으십시오.
2. 흡인기 입 조각을 사용하여 KSOMaa 매체의 방울에 hyaluronidase (10 밀리그램 / ML)의 approximally 1μL를 추가하여 oocytes을 정화하고 1 분에 30 초 동안 37 ° C / 5 % CO ₂ 배양기에 접시를 놓습니다.
3. 흡인기 마우스 조각을 사용하여 KSOMaa 매체 4 신선한 방울과 Oocytes을 씻어 KSOMaa 매체의 최종 드롭에 전송 미네랄 오일 (약 2 ML)와 중첩. oocytes가 주사 준비가 될 때까지 37 ° C / 5 % CO ₂ 배양기에 접시를 놓습니다.
4. 원핵 주입 (무작위 통합).
   1. 입체 현미경으로 알을 시각화하고 약 50 개의 알을 주입 챔버 (droM 배지에 미네랄 오일을 중층 한 것).
   2. 사출 챔버를 거꾸로 현미경으로 옮기고 수정 핵 세포 (두 개의 보이는 전핵)에 주사 핵산을 타겟팅하는 몇 가지 피코 리터를 주입합니다 (전핵의 표적이 될 수 있음). 전핵의 부종을 관찰하여 성공적인 주사를 시각화하십시오.
5. 세포질 주사 (유전자 표적화).
   1. 마우스 조각을 사용하여 5 μg / ML Cytochalasin B를 포함 KSOMaa의 방울로 약 50 계란을 전송하고 37에서 5 분 동안 품어 ° C / 5 % CO ₂ 배양기.
   2. 마우스 피스를 사용하여 주입 챔버에 알을 옮긴다.
   3. 가능한 경우 자동 마이크로 인젝터의 보정 압력을 사용하여 매우 낮은 압력 (50-100 hPa)에서 세포질에 주사 믹스를 몇 피코 리터 주입하십시오.
   4. 주사 후, 난 모세포를 한 방울의 KSOMaa (마우스 피스를 사용)를 37 ° C / 5 % CO ₂ 인큐베이터에 보관하여 의사 임신 여성의 난관으로 재 주입합니다.

8. 이식

1. 모든 스테인레스 스틸 수술기구를 고압 증기 멸균하십시오.
2. 체중계를 사용하여 마우스의 무게를 결정하고 주 사용 마취제 (ketamine 100 MG / kg, xylazine 10 MG / kg)와 intraperitoneal (IP) 주사하여 여성을 마취.
3. 발가락 핀치 반사의 손실을 모니터하고 마우스가 진정되면 발열 패드 위에 올려 놓습니다.
4. 여성 마우스의 지느러미 중간 선 주위에 모피의 넓은 부분을 자르십시오.
5. 클로르헥시딘 (chlorhexidine)과 70 % 에탄올 (ethanol)과 같은 국소 소독제를 번갈아 사용하여 노출 된 피부를 소독하십시오.
6. 전통적인 방법 ^15에 따라 생식 기관을 드러내십시오. 지느러미 정중선과 평행 한 1cm 길이의 피부 절개를 만들고 근육을 자르고 지방 패드를 잡습니다.th 포셉, 그럼 부드럽게 첨부 난관과 자궁이 명확하게 볼 때까지 난소를 꺼내.
7. 지방 패드를 혈관 클램프로 고정하십시오. 입체 현미경으로 난관을 시각화하고 한 쌍의 마이크로 가위를 사용하여 관의 몇 밀리미터 상류에있는 난관의 벽을 절개합니다.
8. 입체 현미경으로 마우스 피스에 연결된 유리 모세관에 25 개의 미세 주입 된 계란을 넣습니다 (모세 혈관의 내경은 약 120 μm 여야합니다). oviduct에 유리 모세관을 도입하고 공기 방울이 ampulla 내부에 보일 때까지 뺍니다.
9. 부드럽게 유리 모세관을 제거하고 복부로 생식 기관을 다시 놓습니다. 3-0 비 흡수성 외과 봉합으로 절개를 봉합 한 다음 상처 클립으로 닫습니다. 전체 복구가 완료 될 때까지 마우스를 면밀히 모니터링하십시오.

9. 유전자 타이핑 전략 / 시퀀싱

참고 : 게놈 분리관련 동물 윤리 규정에 따라 2-mm 꼬리 또는 귀 생검에서 얻은 DNA.

1. 빠른 게놈 DNA 추출 (무작위 통합).
   1. 알칼리 용해 시약 (25 MM 수산화 나트륨 및 0.2 MM EDTA, 산도 = 12)의 100 μL에서 1 시간 95 ° C에서 조직 샘플 (~ 2 mm)을 Lyse.
   2. 중화 시약 (40 mM Tris-HCl, pH = 5) 100 μL를 넣는다.
   3. 12,000 g 및 4 ° C에서 5 분간 원심 분리하십시오.
2. 고품질 게놈 DNA 추출 (유전자 표적화).
   1. 꼬리 버퍼 (50 MM 트리스, 산도 = 8, 100 MM EDTA, 산도 = 8, 100 MM NaCl, 1 % SDS, 0.5 MG / ML proteinase K, 갓 추가)의 500 μL를 추가합니다.
   2. 55 ° C에서 밤새 품어 둡니다.
   3. 반전하여 5 분 동안 혼합하십시오 (vortex하지 마십시오).
   4. 포화 NaCl (6 M) 250 μL를 첨가하고 반전시켜 5 분 동안 혼합한다 (vortex하지 않는다).
   5. 12,000 xg 및 4 ° C에서 5-10 분 동안 스핀하고 상층 액을 새 튜브에 붓습니다.
   6. 500 μl의 이소프로판올을 첨가하고 반전시켜 5 분 동안 혼합한다 (볼텍트하지 마라).
   7. 12,000 xg 및 실온에서 10 분간 회전합니다.
   8. 상층 액을 따라 내고 (펠릿은 보이지 않고 튜브에 달라 붙는다).
   9. 70 % 에탄올 1 mL로 씻으십시오.
   10. 12,000 xg 및 실온에서 5-10 분 동안 스핀. 흰색 펠렛이 더 이상 끈적 거리지 않고 분실 될 수 있으므로 조심스럽게 상등액을 제거하십시오.
   11. 약 1 시간 동안 공기를 건조시킵니다.
   12. TE 버퍼 (10 MM 트리스와 1 MM EDTA, 산도 = 8)의 400 μL를 추가합니다.
   13. 2 시간 동안 55-60 ° C에서 DNA를 녹입니다.
3. 프라이머 디자인.
   1. 전산 도구를 사용하여 최소 20bp의 프라이머를 디자인하십시오 ¹⁹ .
      참고 : 무작위 통합의 경우, 프라이머는 도입 유전자와 혼성화하여 200-800 bp의 분명한 단편을 생성해야합니다. 유전자 타겟팅의 경우 프라이머를 게놈 DNA와 혼성화되도록 디자인하여 뚜렷한 f잘라내는 사이트 주위에 백 백 bp를 분열. 큰 삽입의 경우, 프라이머는 도입 유전자 상에 놓일 수 있지만, 표적 통합의 확인은 프라이머 워킹 (primer walking) 또는 유사한 기술을 사용하여 수행되어야한다.
4. PCR genotyping.
   1. 각 게놈 변형에 대해 새로운 PCR 프로토콜을 설계하고 경험적으로 테스트하십시오. 생성 된 단편의 길이와 각 쌍의 프라이머의 용융 온도 (Tm)를 고려하십시오.
5. 시퀀싱.
   1. 유전자 타겟팅의 경우 PCR 제품을 생거 시퀀싱 서비스 제공 업체에 보내십시오.

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결과

아래에서, 무작위 통합 및 CRISPR 매개 유전자 타겟팅의 경우 microinjection에 대한 워크 플로우가 설명됩니다 ( 그림 1 ).

그림 1 : 유전자 조작 마우스의 일반적인 워크 플로. 무작위 적으로 통합하기 위해 정화 된 형질 도입 유?...

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토론

프로토콜 내 중요 단계

유전자 변형 마우스의 생성은 기술적으로 어려운 것으로 알려져 있습니다. 그러나 여기에 제시된 프로토콜은 기록적인 시간에 기술을 마스터하고 문제를 해결할 수 있도록 최적화되고 단순화 된 방법입니다. 이 기술을 성공적으로 완료하려면 두 단계가 필요합니다. 첫째, 염화 마그네슘 (MgCl ₂ )없이 선형 DNA 템플릿 (sgRNA 합성 용)의 합성이 가능?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micropipette 0.1-2.5 μL	Eppendorf	4920000016
Micropipette 2 - 20 μL	Eppendorf	4920000040
Micropipette 20 - 200 μL	Eppendorf	4920000067
Micropipette 100 - 1,000 μL	Eppendorf	4920000083
Molecular weight marker	Bioline	BIO-33025	HyperLadder 1 kb
Molecular weight marker	Bioline	BIO-33056	HyperLadder 100 bp
Agarose	Bioline	BIO-41025
EDTA buffer	Sigma-Aldrich	93296	10x - Dilute to 1x
Ethidium bromide	Thermo Fisher Scientific	15585011
SYBR Safe gel stain	Invitrogen	S33102
Gel extraction kit	Qiagen	28706
PCR purification kit (Qiaquick)	Qiagen	28106
Vacuum system (Manifold)	Promega	A7231
Nuclease-free microinjection buffer	Millipore	MR-095-10F
Ultrafree-MC microcentrifuge filter	Millipore	UFC30GV00
Cas9 mRNA	Sigma-Aldrich	CAS9MRNA
CRISPR expressing plasmid (px330)	Addgene	42230
Nuclease free water	Sigma-Aldrich	W4502
Phusion polymerase	New England Biolabs	M0530L
T7 Quick High Yield RNA kit	New England Biolabs	E2050S
RNA purification spin columns (NucAway)	Thermo Fisher Scientific	AM10070
ssOligos	Sigma-Aldrich	OLIGO STANDARD
Donor plasmid	Thermo Fisher Scientific	GeneArt
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3884
KSOMaa embryo culture medium	Zenith Biotech	ZEKS-100
Mineral oil	Zenith Biotech	ZSCO-100
M2 Medium	Sigma-Aldrich	M7167
Cytochalasin B	Sigma-Aldrich	C6762
Mouthpiece	Sigma-Aldrich	A5177
Glass microcapillaries	Sutter Instrument	BF100-78-10
Proteinase K	Applichem	A3830.0100
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	91150-20
Iris scissors	Fine Science Tools	91460-11
Vessel clamp	Fine Science Tools	18374-43
Wound clips	Fine Science Tools	12040-01
Clips applier	Fine Science Tools	12018-12
Micro-scissors	Fine Science Tools	15000-03
Cauterizer	Fine Science Tools	18000-00
Non-absorbable surgical sutures (Ethilon 3-0)	Ethicon	1691H
5% CO2 incubator	MG Scientific	Galaxy 14S
Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	Nanodrop 2000c
Thermocycler	Eppendorf	6321 000.515
Electrophoresis set up	BioRad	1640300
UV Transilluminator	BioRad	1708110EDU
Thermocycler	Eppendorf	6334000069
Stereoscopic microscope	Olympus	SZX7
Inverted microscope	Olympus	IX71
2x Micromanipulators	Eppendorf	5188000.012
Oocytes manipulator	Eppendorf	5176000.025
Microinjector (Femtojet)	Eppendorf	5247000.013
Mice C57BL/6J strain	Australian BioResources	C57BL/6JAusb