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Preparation of FFPE DNA and RNA Samples for Sequencing Using an Automated Purification Instrument (API)

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02:34 min

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September 8th, 2023

DOI :

10.3791/200724-v

September 8th, 2023

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Christophe Bontoux¹^,²^,³^,⁴^,⁵, Virginie Lespinet-Fabre¹^,²^,³^,⁴, Olivier Bordone¹^,²^,³^,⁴, Virginie Tanga¹^,²^,³^,⁴, Maryline Allegra¹^,²^,³^,⁴, Myriam Salah¹^,²^,³^,⁴, Salomé Lalvée¹^,²^,³^,⁴, Samantha Goffinet¹^,²^,³^,⁴, Jonathan Benzaquen³^,⁴^,⁵^,⁶, Charles-Hugo Marquette³^,⁴^,⁵^,⁶, Marius Ilié¹^,²^,³^,⁴^,⁵, Véronique Hofman¹^,²^,³^,⁴^,⁵, Paul Hofman¹^,²^,³^,⁴^,⁵

¹Laboratory of Clinical and Experimental Pathology, Centre Hospitalier Universitaire de Nice, Université Côte d’Azur, CHU de Nice, ²Hospital-Integrated Biobank (BB-0033-00025), Université Côte d'Azur, Hôpital Pasteur, CHU de Nice, ³Institut Hospitalo-Universitaire (IHU), RespirERA, Université Côte d'Azur, Hôpital Pasteur, CHU de Nice, ⁴FHU OncoAge, Université Côte d'Azur, ⁵Team 4, Institute of Research on Cancer and Aging (IRCAN), CNRS INSERM, Centre Antoine-Lacassagne, Université Côte d'Azur, ⁶Department of Pulmonary Medicine and Thoracic Oncology, Centre Hospitalier Universitaire de Nice, Université Côte d'Azur

Transcription

Pour commencer, coupez les échantillons d’ADN et d’ARN fixés au formol ou FFPE. Activez l’instrument de purification automatisée ou d’API et connectez-vous à l’aide du nom d’utilisateur et du mot de passe. Ensuite, dans le logiciel Integrated Genomic Viewer, sous échantillons, cliquez sur Créer des échantillons"entrez le nom de l’échantillon et sélectionnez la catégorie d’application.

Après avoir saisi les détails de l’échantillon, cliquez sur Enregistrer"Puis sélectionnez Exécutions"cliquez sur Échantillon jusqu’au résultat » et entrez le nom de l’exécution avant de cliquer sur Suivant"Sélectionnez le test suivi d’un échantillon d’intérêt et cliquez sur Suivant"Après avoir sélectionné chaque échantillon, cliquez sur Attribuer », puis vérifiez les paramètres d’élution et enregistrez l’exécution. Placez les échantillons de tissus FFPE et les tubes de traitement des échantillons. Centrifuger le tube à 2 000 G pendant une minute.

Ajouter le mélange maître Protease Digest préparé à partir d’un kit de purification d’acides nucléiques dans le tube. Incubez l’échantillon à 60 degrés Celsius pendant une heure, puis incubez-le à 90 degrés Celsius pendant une heure. Après avoir refroidi les échantillons, soulevez le tube intérieur du tube de traitement des échantillons et verrouillez-le en tournant à gauche.

Centrifuger la chambre à air à 2 000 g pendant 10 minutes. Déverrouillez ensuite le tube en tournant à droite et en le séparant de l’autre tube. Jetez la chambre à air et placez la chambre à air extérieure sur de la glace jusqu’à ce qu’elle soit chargée sur l’API.

Préparez un mélange maître de digestion de l’ADN et chargez-le dans la plaque de purification d’ADN et d’ARN FFPE préremplie deux. Chargez les échantillons préparés dans la plaque de purification d’ADN et d’ARN FFPE un. Sur l’écran de l’API, cliquez sur Exécuter, puis sélectionnez le plan d’exécution et cliquez sur Suivant, suivez les instructions à l’écran pour charger les consommables et les réactifs requis pour le cycle de purification.

Une fois que tous les réactifs sont chargés, cliquez sur Suivant"fermez la porte de l’API et cliquez sur Démarrer"T à la fin de l’exécution, cliquez sur Décharger » et retirez immédiatement la plaque d’archive d’acides nucléiques à 48 puits contenant l’ADN et l’ARN purifiés. Une fois la purification de l’échantillon terminée, scellez la plaque et stockez-la à moins 80 degrés Celsius.

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