Pour commencer, obtenez l’échantillon monté sur la diapositive après l’avoir vieillie. Pour prétraiter la lame, trempez-la en série dans des bocaux coplin contenant des solutions appropriées pour la durée spécifiée. Digérez le tissu avec 100 à 200 microlitres de tampon de digestion de la protéinase K et incubez à température ambiante pendant une minute.
Pour arrêter la digestion, immergez immédiatement la lame en série dans des solutions d’éthanol pendant deux minutes chacune. Appliquez le mélange d’hybridation FISH sur la lame et recouvrez l’échantillon d’une lamelle. Placez les diapositives sur une plaque chauffante, telle qu’un système d’hybridation Slide Moat à 75 degrés Celsius pendant deux à cinq minutes.
Transférez ensuite la lame sur une autre plaque chauffante réglée à 37 degrés Celsius pour hybrider pendant la nuit. Ensuite, trempez la glissière dans le tampon de lavage chaud et retirez soigneusement la lamelle. Lavez et colorez la lame à l’aide de réactifs appropriés dans l’obscurité.
Trempez rapidement le toboggan dans de l’eau déminéralisée pendant pas plus d’une seconde et placez-le sur une serviette en papier. Après séchage, montez la glissière avec un support de montage anti-décoloration. Placez la lamelle et scellez-la avec du vernis à ongles avant l’imagerie.
À l’aide d’une lentille à huile 60X, capturez le signal fluorescent dans plusieurs piles Z. Enfin, effectuez une projection 3D maximale pour obtenir la meilleure résolution et appliquez la déconvolution ou d’autres algorithmes d’effacement d’arrière-plan. Dans les échantillons de cancer du sein triple négatif, la FISH nucléaire présente principalement deux points distincts par noyau, représentant ses deux signaux ERBB2.
En revanche, les échantillons HER2-positifs présentent des signaux FISH abondants, indiquant différents modèles d’amplification génique. De plus, certains noyaux dans les échantillons HER2-positifs peuvent présenter des grappes, suggérant des centres d’ADN chromosomiques supplémentaires, qui sont des points focaux pour une amplification accrue des gènes.
