Coenzyme A, appelé CoA pour faire court, est un cofacteur important dans le métabolisme cellulaire. Les mesures quantitatives révèlent des changements qui se produisent avec les états nutritionnels et hormonaux dans les modèles animaux. Cette méthode quantifie la quantité totale de CoA cellulaire, y compris les dérivés coa et le CoA gratuit, dans une méthode simple et fiable.
Plusieurs types de neurodégénérescence avec accumulation de fer cérébral sont associés à des mutations dans les gènes de la voie biosynthétique du CoA. Cette méthode peut être appliquée à n’importe quel système biologique puisque tous les organismes ont besoin de CoA pour survivre, se croissancer et fonctionner. Un chercheur pour la première fois peut avoir du mal avec les premières étapes de la préparation de l’échantillon, où il est important de garder les échantillons absolument froids, puis de les transférer rapidement à l’hydroxyde de potassium.
Limitez le nombre d’échantillons dans un lot avant le transfert à l’hydroxyde de potassium, et pratiquez avec le transfert avant de travailler avec les échantillons expérimentaux. De nombreux chercheurs ne connaissent pas l’extraction en phase solide dans la préparation d’échantillons biologiques en vue d’une analyse biochimique ultérieure. Pour commencer, incuber les plats de culture triplicate en parallèle, deux pour l’analyse biochimique et un pour la détermination du nombre de cellules viables.
Lorsque la culture s’approche des densités subconfluentes tardives, par exemple, les cellules humaines HepG2/C3A se sont développées à une densité de six à huit fois 10 à six cellules ou HEK 293T cultivées à une densité d’environ 1,3 fois 10 à la sept par plat de 100 millimètres, récolter les cellules adhérentes dans la culture. Ajouter ensuite un millilitre d’eau glacée au même plat de culture. Racler les cellules dans l’eau froide dans le plat, et transférer la suspension cellulaire dans un tube à essai en verre contenant 400 microlitres d’hydroxyde de potassium molaire de 0,25 et 1,5 millilitres d’eau pour amener le pH au-dessus de 12.
Mélanger vigoureusement la suspension en tourbillonnant à haute hauteur pendant 10 secondes. Ensuite, couvrir hermétiquement avec du film de paraffine, et incuber à 55 degrés Celsius pendant une heure sans trembler dans un bain d’eau. Ajoutez ensuite 160 microlitres de solution trizma-hydrochlorure d’une molaire et 10 microlitres de mBBr de 100 millimillires.
Mélanger en tourbillonnant à haute hauteur pendant 10 secondes. Cela porte le pH à environ huit pour soutenir la réaction mBBr avec coa gratuit. Couvrir le tube de film de paraffine, et incuber les échantillons à température ambiante pendant deux heures dans l’obscurité pour que le mBBr réagisse avec le thiol du CoA.
Après deux heures, ajouter 100 microlitres d’acide acétique, et mélanger par vortex pendant 10 secondes pour arrêter la réaction. Une précipitation se forme dans le tube. Ensuite, centrifugeuse à 2000 fois g pendant 15 minutes.
Pour enlever les débris cellulaires précipités, transférez et économisez le supernatant dans un tube à essai en verre pour le nettoyage de la colonne d’extraction en phase solide. Avant de commencer l’analyse, ajoutez deux millilitres d’hydroxyde de potassium d’un millimère à un tube à essai en verre conçu pour l’insertion d’une sonde et d’une perturbation tissulaire avec un homogénéisateur rotor-stator. Garder le tube sur la glace jusqu’à utilisation.
Pesez rapidement les morceaux de tissu congelés et enregistrez le poids humide pour chaque échantillon. Transférer le tissu dans le tube de verre, et homogénéiser le tissu pendant 30 secondes. Évitez la décongélation complète des tissus.
Ajouter 500 microlitres d’hydroxyde de potassium molaire de 0,25 molar. Vortex à haute hauteur pendant 10 secondes, et garder sur la glace. Cela porte le pH de l’échantillon au-dessus de 12 pour hydrolyser les thioesters CoA pour produire le coa total.
Couvrir le tube de film de paraffine. La préparation des cellules de culture et la préparation des tissus sont les étapes les plus critiques de cette procédure. Il est important d’ajouter rapidement de l’hydroxyde de potassium élevé pour prévenir la dégradation du CoA.
Incuber les échantillons à 55 degrés Celsius pendant deux heures dans un bain d’eau sans trembler pour soutenir l’hydrolyse. Ensuite, ajoutez 150 microlitres de trizma-hydrochlorure d’une molaire et 10 microlitres de mBBr de 100 millimolaires pour porter le pH à environ huit pour soutenir la réaction mBBr avec du CdA libre. Vortex à haute hauteur pendant 10 secondes.
Couvrir le tube avec du film de paraffine, et incuber les échantillons à température ambiante pendant deux heures dans l’obscurité pour s’assurer que tout le CoA est dérivé avec mBBr. Après cela, ajouter 100 microlitres d’acide acétique, et vortex à haute pendant 10 secondes pour arrêter la réaction. Centrifugeuse à 2000 fois g pendant 15 minutes pour pelleter les débris cellulaires précipités, et transférer le supernatant dans un tube à essai en verre pour le nettoyage de la colonne d’extraction en phase solide.
À température ambiante, équilibrer chaque colonne de gel de silice jetable d’un millilitre de 2-2-pyridyl-éthyl avec un millilitre de tampon de lavage pour s’assurer que le groupe fonctionnel pyridyle est protoné et fonctionnera comme un échangeur d’anion. Ensuite, pipette l’échantillon supernatant sur la colonne, et de recueillir l’élitate. Lavez la colonne deux fois avec un millilitre de tampon de lavage et une fois avec un millilitre d’eau pour éliminer toute espèce non protégée.
Ensuite, dans un tube à essai en verre séparé, laver la colonne deux fois avec un millilitre de tampon d’élitution pour recueillir le CoA-bimane. Sécher l’échantillon de CoA-bimane dans le tube sous le gaz azoté. Sceller, couvrir complètement le tube et le conserver à moins 20 degrés Celsius.
Lorsqu’il est prêt pour l’analyse HPLC, resuspendez l’échantillon dans 300 microlitres d’eau, et mélangez vigoureusement en tourbillonnant à haute température pendant 10 secondes. Transférer l’échantillon réutilisé dans un filtre à tube de centrifugeuse, et la centrifugeuse à 5000 fois g pendant 10 minutes pour enlever tout précipitation. Ensuite, transférez l’échantillon filtré sur un flacon de verre adapté à l’injection HPLC.
Dans cette étude, un profil hplc représentatif montre le temps de rétention de la norme CoA-bimane sur la colonne C18 HPLC. Des quantités croissantes de la norme CoA-bimane ont été injectées individuellement, et les zones sous les sommets des chromatogrammes CoA-bimane ont été tracées en fonction de l’entrée CoA-bimane. La courbe standard reflétait l’ampleur de l’absorption du CoA-bimane à une longueur d’onde de 393 nanomètres.
La fluorescence du CoA-bimane s’est également reflétée à la longueur d’onde d’excitation de 393 nanomètres et à la longueur d’onde d’émission de 470 nanomètres. La séparation ultérieure du HPLC et les profils de détection typiques pour le foie de souris ou les cellules C3A d’culture humaine sont indiqués ici par des pics rouges, avec un temps de rétention entre 11 et 12 minutes en utilisant le programme d’élitution. Si la réaction avec mBBr ne donne pas de résultats détectables, la quantité de Trizma-HCl peut devoir être ajustée pour abaisser le pH à environ huit.
Il est possible de détecter d’autres molécules cellulaires qui contiennent du sulfhydryle ou du thioester moieties comme dérivés bimanes. Par exemple, le glutathion-bimane peut être détecté avec la méthode HPLC. Cette technique permettra à d’autres chercheurs d’étudier le rôle potentiel du dysfonctionnement du CoA associé au déséquilibre métabolique, comme les modèles animaux du diabète de type 2.
Les chercheurs devraient utiliser de l’équipement de protection individuelle lorsqu’ils travaillent avec des solvants organiques utilisés pour l’extraction en phase solide.
