Коэнзим А, называемый CoA для краткости, является важным кофактором в клеточном метаболизме. Количественные измерения показывают изменения, которые происходят с питательными и гормональными состояниями в животных моделях. Этот метод количественно общее количество сотовых CoA, в том числе производных CoA и бесплатно CoA, в простой, надежный метод.
Несколько типов нейродегенерации с накоплением железа мозга связаны с мутациями в генах биосинтетических путей КоА. Этот метод может быть применен к любой биологической системе, так как все организмы требуют CoA для выживания, роста и функции. Впервые исследователь может бороться с первыми шагами в подготовке образца, где важно держать образцы абсолютно холодными, а затем быстро передавать их гидроксиду калия.
Ограничьте количество образцов в партии перед переходом на гидроксид калия и попрактикуйтесь в передаче перед работой с экспериментальными образцами. Многие исследователи не знакомятся с твердой фазой экстракции при подготовке биологических образцов для более поздних биохимических анализов. Для начала инкубировать тройной культуры блюда параллельно, два для биохимического анализа и один для определения жизнеспособного числа клеток.
Когда культура приближается к поздней плотности субвлияния, например, человеческие клетки HepG2/C3A выросли до плотности от шести до восьми раз от шести до шести или HEK 293T клеток, выращенных с плотностью около 1,3 раза от 10 до семи на 100-миллиметровую тарелку, урожай приверженцев клеток в культуре. Затем добавьте один миллилитр ледяной воды в одно и то же культурное блюдо. Очистите клетки в холодную воду в тарелке, и передать клеточной подвески в стеклянной пробирке, содержащей 400 микролитров 0,25-молярного гидроксида калия и 1,5 миллилитров воды, чтобы принести рН выше 12.
Смешайте подвеску энергично вихрем на высоком в течение 10 секунд. Затем плотно накройте парафиновой пленкой и инкубировать при 55 градусах по Цельсию в течение одного часа, не встряхивая в водяной бане. Затем добавьте 160 микролитров раствора одномолярной тризмы-гидрохлорида и 10 микролитров 100-миллимолярной мББр.
Смешайте вихрем на высоком в течение 10 секунд. Это приводит рН примерно до восьми для поддержки реакции mBBr со свободным CoA. Обложка трубки с парафиновой пленкой, и инкубировать образцы при комнатной температуре в течение двух часов в темноте для mBBr реагировать с тиолом CoA.
Через два часа добавьте 100 микролитров уксусной кислоты и перемешайте вихрем в течение 10 секунд, чтобы остановить реакцию. В трубке образуется осадк. Далее, центрифуга на 2000 раз г в течение 15 минут.
Чтобы удалить осажденный клеточный мусор, перенесите и сохраните супернатант в стеклянную пробирку для очистки столба извлечения твердой фазы. Перед началом анализа добавьте два миллилитров гидроксида калия в стеклянную пробирку, предназначенную для вставки зонда и разрушения тканей с помощью гомогенизатора ротора-статора. Держите трубку на льду до использования.
Взвесить замороженные части ткани быстро, и записывать мокрый вес для каждого образца. Перенесите ткань в стеклянную трубку и гомогенизируйте ткань в течение 30 секунд. Избегайте полного оттаивания тканей.
Добавьте 500 микролитров 0,25-молярного гидроксида калия. Вихрь на высоте в течение 10 секунд, и держать на льду. Это приносит рН образца выше 12 для гидролиза CoA thioesters для того чтобы дать полный CoA.
Обложка трубки с парафиновой пленкой. Подготовка культурных клеток и подготовка тканей являются наиболее важными шагами в этой процедуре. Важно, чтобы добавить высокий гидроксид калия быстро, чтобы предотвратить деградацию КоА.
Инкубировать образцы при 55 градусах по Цельсию в течение двух часов в водяной бане без тряски для поддержки гидролиза. Затем добавьте 150 микролитров одномолярного тризмы-гидрохлорида и 10 микролитров 100-миллимолярной мББр, чтобы довести рН примерно до восьми для поддержки реакции mBBr со свободным CoA. Вихрь на высоте в течение 10 секунд.
Обложка трубки с парафиновой пленкой, и инкубировать образцы при комнатной температуре в течение двух часов в темноте, чтобы обеспечить все CoA является производным с mBBr. После этого добавьте 100 микролитров уксусной кислоты и вихрь на высоком уровне в течение 10 секунд, чтобы остановить реакцию. Центрифуга в 2000 раз г в течение 15 минут, чтобы гранулы осаждается клеточного мусора, и передачи супернатанта в стеклянную пробирку для твердой фазы извлечения столба очистки.
При комнатной температуре, равномерный каждый один миллилитр одноразовые 2-2-пиридил-этиловый кремнезем гель колонки с одним миллилитров мыть буфера для обеспечения того, чтобы пиридил функциональной группы протонируется и будет функционировать как обменник аниона. Затем, пипетка образца supernatant на колонку, и собирать eluate. Вымойте столбец дважды с одним миллилитров мыть буфера и один раз с одним миллилитром воды, чтобы удалить любые неустановимые виды.
Затем, в отдельную стеклянную пробирку, мыть колонку дважды с одним миллилитров элюционного буфера для сбора CoA-bimane. Высушите образец CoA-bimane в трубке под азотным газом. Печать, полностью покрыть трубку, и хранить при температуре минус 20 градусов по Цельсию.
Когда он будет готов к анализу HPLC, повторно посвястите образец в 300 микролитров воды и энергично смешивайте вихрем на максимуме в течение 10 секунд. Перенесите распровоцированный образец в центрифугный трубчатый фильтр и центрифугу при 5 000 раз г в течение 10 минут, чтобы удалить любой осадк. Затем перенесите отфильтрованный образец на стеклянный флакон, пригодный для инъекций HPLC.
В этом исследовании репрезентативный профиль HPLC показывает время хранения стандарта CoA-bimane в столбце C18 HPLC. Все большее количество стандарта CoA-bimane вводилось индивидуально, и области под пиками в хроматограммах CoA-bimane были построены как функция входного CoA-bimane. Стандартная кривая отражала величину поглощения КоА-бимана на длине волны 393 нанометров.
Флуоресценция КоА-бимана также отразилась на возбудительной длине волны 393 нанометров и длине волны выбросов 470 нанометров. Последующее разделение HPLC и типичные профили обнаружения для печени мыши или человеческих культурных клеток C3A показаны здесь красными пиками, с временем удержания от 11 до 12 минут с помощью программы elution. Если реакция с mBBr не дает обнаруживаемых результатов, количество Trizma-HCl, возможно, потребуется настроить, чтобы снизить рН примерно до восьми.
Можно обнаружить дополнительные клеточные молекулы, которые содержат сульфгидрил или тиоэстер moieties как биман производные. Например, глутатион-биман можно обнаружить методом HPLC. Этот метод позволит другим исследователям исследовать потенциальную роль дисфункции CoA связанной с метаболическим дисбалансом, such as животные модели мочеизнурения типа 2.
Исследователи должны использовать средства индивидуальной защиты при работе с органическими растворителями, используемыми для извлечения твердой фазы.
