Coenzym A, kurz CoA genannt, ist ein wichtiger Cofaktor im Zellstoffwechsel. Quantitative Messungen zeigen Veränderungen, die mit Ernährungs- und Hormonzuständen in Tiermodellen auftreten. Diese Methode quantitiert die Gesamtmenge der zellulären CoA, einschließlich CoA-Derivate und freie CoA, in einer einfachen, zuverlässigen Methode.
Mehrere Arten der Neurodegeneration mit Gehirneisenakkumulation sind mit Mutationen in den Genen des biosynthetischen CoA-Signalwegs verbunden. Diese Methode kann auf jedes biologische System angewendet werden, da alle Organismen CoA für Überleben, Wachstum und Funktion benötigen. Ein Erstforscher kann mit den ersten Schritten in der Probenvorbereitung zu kämpfen, wo es wichtig ist, die Proben absolut kalt zu halten und sie dann schnell in Kaliumhydroxid zu übertragen.
Beschränken Sie die Anzahl der Proben in einer Charge vor der Übertragung auf Kaliumhydroxid, und üben Sie mit der Übertragung vor der Arbeit mit den experimentellen Proben. Viele Forscher sind nicht mit Festphasenextraktion bei der Herstellung biologischer Proben für spätere biochemische Analysen vertraut. Zunächst dreitduzieren Sie parallel dreifache Kulturgerichte, zwei für die biochemische Analyse und eine zur Bestimmung der lebensfähigen Zellzahl.
Wenn sich die Kultur den späten subkonfluenten Dichten nähert, z. B. menschliche HepG2/C3A-Zellen, die auf eine Dichte von sechs bis acht mal 10 zu den sechs oder HEK 293T-Zellen herangewachsen sind, die auf eine Dichte von etwa 1,3 mal 10 bis zu den sieben pro 100-Millimeter-Schale angewachsen sind, ernten sie die anhaftenden Zellen in der Kultur. Dann fügen Sie ein Milliliter eiskaltes Wasser in das gleiche Kulturgericht. Verschrotten Sie Zellen in das kalte Wasser in der Schale, und übertragen Sie die Zellsuspension in ein Glas-Reagenzglas mit 400 Mikrolitern 0,25-Molar-Kaliumhydroxid und 1,5 Milliliter Wasser, um den pH-Wert über 12 zu bringen.
Mischen Sie die Federung kräftig, indem Sie 10 Sekunden lang hoch wirbeln. Dann fest mit Paraffinfolie bedecken und bei 55 Grad Celsius eine Stunde lang bebrüten, ohne im Wasserbad zu zittern. Dann fügen Sie 160 Mikroliter ein-Molar Trizma-Hydrochlorid-Lösung und 10 Mikroliter von 100-Millimolar mBBr.
Mischen Sie durch Wirbel auf hoch für 10 Sekunden. Dadurch erhöht sich der pH-Wert auf etwa acht, um die mBBr-Reaktion mit freiem CoA zu unterstützen. Bedecken Sie das Rohr mit Paraffinfolie, und inkubieren Sie die Proben bei Raumtemperatur für zwei Stunden im Dunkeln, damit das mBBr mit dem Thiol von CoA reagiert.
Nach zwei Stunden 100 Mikroliter Essigsäure hinzufügen und durch Wirbeln 10 Sekunden mischen, um die Reaktion zu stoppen. In der Röhre bildet sich ein Niederschlag. Als nächstes Zentrifuge bei 2.000 mal g für 15 Minuten.
Um die gefällten Zellablagerungen zu entfernen, übertragen und speichern Sie den Überstand in einem Glas-Reagenzglas für die Vollphasen-Extraktionssäulenreinigung. Vor Beginn der Analyse zwei Milliliter Kaliumhydroxid mit einem Millimolaren in ein Glas-Reagenzglas geben, das für das Einsetzen einer Sonde und Gewebestörungen mit einem Rotor-Stator-Homogenisator entwickelt wurde. Halten Sie die Röhre auf Eis, bis sie verwendet wird.
Wiegen Sie die gefrorenen Gewebestücke schnell und notieren Sie das Nassgewicht für jede Probe. Übertragen Sie das Gewebe in das Glasrohr und homogenisieren Sie das Gewebe für 30 Sekunden. Vermeiden Sie ein vollständiges Auftauen des Gewebes.
500 Mikroliter 0,25-molares Kaliumhydroxid hinzufügen. Wirbel auf hoch für 10 Sekunden, und auf Eis zu halten. Dies bringt den pH-Wert der Probe über 12, um die CoA-Thioester zu hydrolysieren, um insgesamt CoA zu liefern.
Bedecken Sie die Röhre mit Paraffinfolie. Die Herstellung von kultivierten Zellen und die Herstellung von Geweben sind die wichtigsten Schritte in diesem Verfahren. Es ist wichtig, schnell hohe Kaliumhydroxid hinzufügen, um CoA Abbau zu verhindern.
Inkubieren Sie die Proben bei 55 Grad Celsius für zwei Stunden in einem Wasserbad, ohne zu schütteln, um die Hydrolyse zu unterstützen. Fügen Sie dann 150 Mikroliter ein-Molar-Trizma-Hydrochlorid und 10 Mikroliter 100-Millimolar mBBr hinzu, um den pH-Wert auf etwa acht zu bringen, um die mBBr-Reaktion mit freiem CoA zu unterstützen. Wirbel auf hoch für 10 Sekunden.
Bedecken Sie das Rohr mit Paraffinfolie, und inkubieren Sie die Proben bei Raumtemperatur für zwei Stunden im Dunkeln, um sicherzustellen, dass alle CoA mit mBBr abgeführt werden. Danach 100 Mikroliter Essigsäure hinzufügen und 10 Sekunden lang hoch wirbeln, um die Reaktion zu stoppen. Zentrifuge bei 2.000 mal g für 15 Minuten, um ausgefällten Zellschutt zu pelleten und den Überstand in ein Glas-Reagenzglas für die Festphasen-Extraktionssäulenreinigung zu übertragen.
Bei Raumtemperatur gleichziehen Sie jede Einweg-2-2-Pyridyl-Ethyl-Kieselgelsäule mit einem Milliliter Waschpuffer, um sicherzustellen, dass die Pyridylfunktionsgruppe protoniert ist und als Anionenaustauscher fungiert. Dann pipette die Probe Überstand auf die Säule, und sammeln Sie das Eluat. Waschen Sie die Säule zweimal mit einem Milliliter Waschpuffer und einmal mit einem Milliliter Wasser, um alle nicht zurückgehaltenen Arten zu entfernen.
Als nächstes, in ein separates Glas-Reagenzglas, waschen Sie die Säule zweimal mit einem Milliliter Elutionspuffer, um das CoA-Bimane zu sammeln. Trocknen Sie die CoA-Bimane-Probe im Rohr unter Stickstoffgas. Versiegeln, das Rohr vollständig abdecken und bei minus 20 Grad Celsius lagern.
Wenn Sie für die HPLC-Analyse bereit sind, setzen Sie die Probe in 300 Mikroliter Wasser wieder auf und mischen Sie sie kräftig, indem Sie 10 Sekunden lang hoch wirbeln. Die resuspendierte Probe in einen Zentrifugenrohrfilter und zentrifugieren Sie 10 Minuten lang 5.000 mal g, um einen Niederschlag zu entfernen. Übertragen Sie dann die gefilterte Probe in eine Glasdurchstechflasche, die für die HPLC-Injektion geeignet ist.
In dieser Studie zeigt ein repräsentatives HPLC-Profil die Retentionszeit des CoA-Bimane-Standards auf der C18 HPLC-Säule. Immer größere Mengen des CoA-Bimane-Standards wurden einzeln injiziert, und die Bereiche unter den Spitzen der CoA-Bimane-Chromatogramme wurden in Abhängigkeit vom Eingang CoA-Bimane dargestellt. Die Standardkurve spiegelte die Größe der Absorption von CoA-Bimane bei einer Wellenlänge von 393 Nanometern wider.
Die Fluoreszenz von CoA-Bimane wurde auch bei der Anregungswellenlänge von 393 Nanometern und einer Emissionswellenlänge von 470 Nanometern reflektiert. Nachfolgende HPLC-Trennung und typische Detektionsprofile für Mausleber oder humankultivierte C3A-Zellen werden hier durch rote Peaks mit einer Retentionszeit zwischen 11 und 12 Minuten mit dem Elutionsprogramm angezeigt. Wenn die Reaktion mit mBBr keine nachweisbaren Ergebnisse liefert, muss die Menge an Trizma-HCl möglicherweise angepasst werden, um den pH-Wert auf etwa acht zu senken.
Es ist möglich, zusätzliche zelluläre Moleküle zu erkennen, die Sulfhydryl- oder Thioester-Moieties als Bimane-Derivate enthalten. Beispielsweise kann Glutathion-Bimane mit der HPLC-Methode erkannt werden. Diese Technik wird es anderen Forschern ermöglichen, die potenzielle Rolle von CoA-Dysfunktion im Zusammenhang mit metabolischen Ungleichgewichten zu untersuchen, wie Tiermodelle von Typ-2-Diabetes.
Bei der Arbeit mit organischen Lösungsmitteln, die für die Festphasenextraktion verwendet werden, sollten die Forscher persönliche Schutzausrüstungen verwenden.
