Il coenzima A, chiamato CoA in breve, è un importante cofattore nel metabolismo cellulare. Le misurazioni quantitative rivelano cambiamenti che si verificano con stati nutrizionali e ormonali nei modelli animali. Questo metodo quantifica la quantità totale di CoA cellulare, inclusi i derivati CoA e il CoA libero, in un metodo semplice e affidabile.
Diversi tipi di neurodegenerazione con accumulo di ferro cerebrale sono associati a mutazioni nei geni della via biosintetica CoA. Questo metodo può essere applicato a qualsiasi sistema biologico poiché tutti gli organismi richiedono CoA per la sopravvivenza, la crescita e la funzione. Un ricercatore per la prima volta può lottare con i primi passi nella preparazione del campione, dove è importante mantenere i campioni assolutamente freddi e poi trasferirli rapidamente in idrossido di potassio.
Limitare il numero di campioni in un lotto prima del trasferimento in idrossido di potassio e esercitarsi con il trasferimento prima di lavorare con i campioni sperimentali. Molti ricercatori non conoscono l'estrazione in fase solida nella preparazione di campioni biologici per successive analisi biochimiche. Per iniziare, incubare i piatti di coltura triplicati in parallelo, due per l'analisi biochimica e uno per la determinazione del numero di cellule vitali.
Quando la coltura si avvicina alle densità subconfluenti tardive, ad esempio, le cellule Umane HepG2/C3A coltivate ad una densità da sei a otto volte 10 alle cellule sei o HEK 293T coltivate ad una densità di circa 1,3 per 10 al sette per piatto da 100 millimetri, raccolgono le cellule aderenti nella coltura. Quindi, aggiungere un millilitro di acqua ghiacciata allo stesso piatto di coltura. Raschiare le cellule nell'acqua fredda nel piatto e trasferire la sospensione cellulare in una provetta di vetro contenente 400 microlitri di idrossido di potassio 0,25 molare e 1,5 millilitri di acqua per portare il pH sopra i 12.
Mescolare vigorosamente la sospensione vortice in alto per 10 secondi. Quindi coprire strettamente con pellicola di paraffina e incubare a 55 gradi Celsius per un'ora senza tremare in un bagno d'acqua. Quindi, aggiungere 160 microlitri di soluzione trizma-cloridrato un molare e 10 microlitri da 100 millimolare mBBr.
Mescolare in vortice in alto per 10 secondi. Questo porta il pH a circa otto per supportare la reazione mBBr con CoA libero. Coprire il tubo con pellicola di paraffina e incubare i campioni a temperatura ambiente per due ore al buio affinché l'mBR reagisca con il tiolo di CoA.
Dopo due ore, aggiungere 100 microlitri di acido acetico e mescolare vortice per 10 secondi per fermare la reazione. Una precipitazione si forma nel tubo. Quindi, centrifuga a 2.000 volte g per 15 minuti.
Per rimuovere i detriti cellulari precipitati, trasferire e salvare il supernatante in una provetta di vetro per la pulizia della colonna di estrazione in fase solida. Prima di iniziare l'analisi, aggiungere due millilitri di idrossido di potassio millimolare a una provetta di vetro progettata per l'inserimento di una sonda e interruzione dei tessuti con un omogeneizzatore rotore-statore. Tenere il tubo sul ghiaccio fino all'uso.
Pesare rapidamente i pezzi di tessuto congelato e registrare il peso umido per ogni campione. Trasferire il tessuto nel tubo di vetro e omogeneizzare il tessuto per 30 secondi. Evitare lo scongelamento completo del tessuto.
Aggiungere 500 microlitri di idrossido di potassio 0,25 molare. Vortice in alto per 10 secondi, e tenere sul ghiaccio. Ciò porta il pH del campione sopra 12 ad idrolizzare i tioestri coa per produrre CoA totale.
Coprire il tubo con pellicola di paraffina. La preparazione di cellule coltivate e la preparazione dei tessuti sono i passaggi più critici in questa procedura. È importante aggiungere rapidamente idrossido di potassio alto per prevenire la degradazione della CoA.
Incubare i campioni a 55 gradi Celsius per due ore in un bagno d'acqua senza tremare per sostenere l'idrolisi. Quindi, aggiungere 150 microlitri di Trizma-cloridrato di un molare e 10 microlitri di mBBr da 100 millimolari per portare il pH a circa otto per supportare la reazione mBBr con CoA libero. Vortice in alto per 10 secondi.
Coprire il tubo con pellicola di paraffina e incubare i campioni a temperatura ambiente per due ore al buio per assicurarsi che tutta la CoA sia derivatizzata con mBBr. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di acido acetico e vortice in alto per 10 secondi per fermare la reazione. Centrifugare a 2.000 volte g per 15 minuti per i detriti cellulari precipitati a pellet e trasferire il supernatante in una provetta di vetro per la pulizia della colonna di estrazione in fase solida.
A temperatura ambiente, equilibrare ogni colonna di gel di silice usa e getta da 2-2-piridil-etile con un millilitro di tampone di lavaggio per garantire che il gruppo funzionale pirindilico sia protonato e funzioni come scambiatore di anione. Quindi, pipettare il supernatante campione sulla colonna e raccogliere l'eluato. Lavare la colonna due volte con un millilitro di tampone di lavaggio e una volta con un millilitro d'acqua per rimuovere eventuali specie non contaminate.
Successivamente, in una provetta di vetro separata, lavare la colonna due volte con un millilitro di tampone di eluizione per raccogliere il CoA-bimane. Asciugare il campione di CoA-bimano nel tubo sotto gas azoto. Sigillare, coprire completamente il tubo e conservare a meno 20 gradi Celsius.
Quando è pronto per l'analisi HPLC, rimescolare il campione in 300 microlitri di acqua e mescolare vigorosamente a vortice in alto per 10 secondi. Trasferire il campione rimorsi su un filtro a tubo di centrifuga e centrifugare a 5.000 volte g per 10 minuti per rimuovere qualsiasi precipitante. Quindi, trasferire il campione filtrato su una fiala di vetro adatta all'iniezione HPLC.
In questo studio, un profilo HPLC rappresentativo mostra il tempo di conservazione dello standard CoA-bimane sulla colonna HPLC C18. Quantità crescenti dello standard CoA-bimane sono state iniettate singolarmente, e le aree sotto i picchi nei cromatogrammi CoA-bimane sono state tracciate in funzione dell'ingresso CoA-bimane. La curva standard rifletteva la grandezza dell'assorbanza del CoA-bimano ad una lunghezza d'onda di 393 nanometri.
La fluorescenza del CoA-bimano è stata riflessa anche alla lunghezza d'onda di eccitazione di 393 nanometri e alla lunghezza d'onda di emissione di 470 nanometri. La successiva separazione HPLC e i profili di rilevamento tipici per il fegato di topo o le cellule C3A coltivate dall'uomo sono indicati qui da picchi rossi, con un tempo di ritenzione compreso tra 11 e 12 minuti utilizzando il programma di eluizione. Se la reazione con mBBr non produce risultati rilevabili, potrebbe essere necessario regolare la quantità di Trizma-HCl per abbassare il pH a circa otto.
È possibile rilevare molecole cellulari aggiuntive che contengono moieties sulfhydryl o tioester come derivate bimane. Ad esempio, il glutatione-bimano può essere rilevato con il metodo HPLC. Questa tecnica consentirà ad altri ricercatori di indagare il potenziale ruolo della disfunzione della CoA associata allo squilibrio metabolico, come i modelli animali del diabete di tipo 2.
I ricercatori dovrebbero utilizzare dispositivi di protezione individuale quando lavorano con solventi organici utilizzati per l'estrazione in fase solida.
