Coa라고 불리는 Coenzyme A는 세포 대사의 중요한 보조 요소입니다. 정량적 측정은 동물 모델의 영양 및 호르몬 상태에서 발생하는 변화를 보여줍니다. 이 방법은 간단하고 신뢰할 수있는 방법으로 CoA 파생 상품 및 무료 CoA를 포함한 셀룰러 CoA의 총 양을 양량.
뇌 철 축적과 신경 변성의 여러 유형은 CoA 생합성 경로의 유전자에 있는 돌연변이와 연관됩니다. 이 방법은 모든 유기체가 생존, 성장 및 기능에 대한 CoA를 필요로하기 때문에 모든 생물학적 시스템에 적용 될 수있다. 처음 연구원은 시료를 절대적으로 차갑게 유지하고 수산화 칼륨으로 신속하게 옮기는 것이 중요한 샘플 준비의 첫 번째 단계로 어려움을 겪을 수 있습니다.
수산화칼륨으로 옮기기 전에 일괄 처리된 시료수를 제한하고 실험 용 시료로 작업하기 전에 이송과 함께 연습합니다. 많은 연구원은 나중에 생화확적인 분석을 위한 생물학 견본의 준비에 있는 고체 상 추출에 익숙하지 않습니다. 우선, 배양 접시를 병렬로 배양, 생화학 적 분석을 위한 2개, 실행 가능한 세포 수의 측정을 위한 요리인배기를 배양하는 배구를 배양한다.
배양이 후기 하위 밀도에 접근할 때, 예를 들어, 인간 HepG2/C3A 세포는 6~8배 의 밀도로 성장하여 6또는 HEK 293T 세포의 밀도로 성장하여 100mm 당 7배 에서 약 1.3배 의 밀도로 성장하여 배양에서 부착세포를 수확한다. 그런 다음, 같은 문화 요리에 얼음 차가운 물 1 밀리리터를 추가합니다. 식기의 차가운 물에 세포를 긁어 내고, 세포 현탁액을 0.25-어금니 칼륨 수산화칼륨과 1.5 밀리리터의 물 400마이크로리터를 포함하는 유리 시험 관으로 이송하여 12 위에 pH를 가져온다.
10초 동안 높은 에서 소용돌이를 통해 서스펜션을 적극적으로 섞습니다. 그런 다음 파라핀 필름으로 단단히 덮고 수조에서 흔들리지 않고 1 시간 동안 섭씨 55도에서 배양하십시오. 그런 다음 1개의 어금니 트리즈마-염산염 용액 160마이크로리터와 100밀리마일러 mBBr의 10마이크로리터를 추가합니다.
10초 동안 높은 에서 소용돌이에 섞으세요. 이것은 무료 CoA와 mBBr 반응을 지원하기 위하여 대략 8에 pH를 가져옵니다. 파라핀 필름으로 튜브를 덮고, mBBr이 CoA의 티올과 반응하기 위해 어둠 속에서 2 시간 동안 실온에서 샘플을 배양합니다.
2시간 후, 아세트산 100마이크로리터를 넣고 10초 동안 소용돌이하여 반응을 멈춥시다. 튜브의 강수량 은 형성됩니다. 다음으로 원심분리기는 2, 000배 g에서 15분간.
침전된 세포 이물질을 제거하려면, 고체 위상 추출 컬럼 청소를 위해 유리 시험관에 상체물을 이송하고 저장한다. 분석을 시작하기 전에, 로터 -stator 균질화로 프로브와 조직 중단의 삽입을 위해 설계된 유리 테스트 튜브에 1 밀리머 칼륨 수산화칼륨의 두 밀리리터를 추가합니다. 튜브를 사용할 때까지 얼음 위에 보관하십시오.
냉동 조직 조각을 빠르게 계량하고 각 샘플에 대한 젖은 무게를 기록합니다. 조직을 유리 튜브로 옮기고 조직을 30초 동안 균질화합니다. 조직의 완전한 해동을 피하십시오.
수산화 칼륨 0.25-마이크로리터 500개추가. 10 초 동안 높은 소용돌이, 얼음에 유지. 이것은 총 CoA를 산출하기 위하여 CoA 티오에스테르를 가수분해하기 위하여 위의 견본의 pH를 12를 가져옵니다.
파라핀 필름으로 튜브를 덮습니다. 배양 된 세포의 준비와 조직의 준비는이 절차에서 가장 중요한 단계입니다. CoA 분해를 방지하기 위해 수산화 칼륨을 신속하게 추가하는 것이 중요합니다.
수조에서 2시간 동안 55도의 시료를 배양하여 가수분해를 지원합니다. 그런 다음, 1-m-mBBr 150 마이크로리터와 100밀리머 mBBr의 마이크로리터를 추가하여 무료 CoA로 mBBr 반응을 지원하기 위해 pH를 약 8개에 넣습니다. 10 초 동안 높은 소용돌이.
파라핀 필름으로 튜브를 덮고 모든 CoA가 mBBr으로 파생되도록 어둠 속에서 2 시간 동안 실온에서 샘플을 배양합니다. 그 후, 아세트산의 100 마이크로 리터를 추가하고, 반응을 중지10 초 동안 높은 에 소용돌이. 원심분리기는 15분 동안 2, 000배 g에서 침전된 세포 이물질을 펠릿하고, 상체를 유리 시험관으로 이송하여 고체 상 추출 컬럼 을 정화한다.
실온에서, 각 1밀리리터 일회용 2-2-pyridyl-ethyl 실리카 젤 컬럼을 1밀리리터의 세척 버퍼로 평형하여 피리딜 기능성 그룹이 양성되고 음이온 교환기로 작동하도록 합니다. 그런 다음 샘플 상체를 기둥에 피펫하고 용액을 수집합니다. 세탁 버퍼 1밀리리터로 컬럼을 두 번 씻고, 한 번은 1밀리리터의 물로 씻어 유지되지 않은 종을 제거합니다.
다음으로, 별도의 유리 테스트 튜브로, CoA-bimane을 수집하기 위해 용출 버퍼 1 밀리리터로 컬럼을 두 번 세척합니다. 질소 가스 하에서 튜브에서 CoA-bimane 샘플을 건조시. 밀봉하고 튜브를 완전히 덮고 영하 20도에 보관하십시오.
HPLC 분석을 위해 준비되면 300 마이크로리터의 물에서 샘플을 다시 중단하고 10초 동안 높은 에서 소용돌이를 통해 적극적으로 섞습니다. 리펜시프튜브 필터로 재중단된 샘플을 옮기고, 원심분리기를 10분 동안 5, 000배 g에서 전달하여 침전제를 제거합니다. 이어서, 여과된 시료를 HPLC 주입에 적합한 유리 유리 바이알로 이송한다.
이 연구에서는 대표적인 HPLC 프로파일이 C18 HPLC 열에서 CoA-bimane 표준의 보존 시간을 보여줍니다. CoA-bimane 표준의 증가양은 개별적으로 주입되었고, CoA-bimane 크로마토그램의 피크 아래 영역은 입력 CoA-bimane의 함수로 플롯되었다. 표준 곡선은 393 나노미터의 파장에서 CoA-bimane의 흡광도의 크기를 반영했다.
CoA-bimane의 형광은 또한 393 나노미터의 내분 파장 및 470 나노미터의 방출 파장에 반영되었다. 마우스 간 또는 인간 배양 C3A 세포에 대한 후속 HPLC 분리 및 전형적인 검출 프로파일은 용출 프로그램을 사용하여 11 분에서 12 분 사이의 유지 시간으로 빨간색 피크로 여기에 표시됩니다. mBBr과의 반응이 검출 가능한 결과를 산출하지 않으면, Trizma-HCl의 양은 pH를 약 8으로 낮추기 위해 조정되어야 할 수도 있다.
비마네 유도체로서 설피드릴 또는 티오에스테르 모이티를 함유하는 추가 세포 분자를 검출할 수 있다. 예를 들어, 글루타티온-비마네는 HPLC 방법으로 검출될 수 있다. 이 기술은 그밖 연구원이 타입-2 당뇨병의 동물 모형과 같은 신진 대사 불균형과 관련되었던 CoA 기능 장애의 잠재적인 역할을 조사하는 것을 허용할 것입니다.
연구원은 고체 상 추출에 사용되는 유기 용매로 작업 할 때 개인 보호 장비를 사용해야합니다.
