Ce protocole facilite une mesure fiable des propriétés mécaniques membranaires de la vésicule lipidique synthétique et réelle en polymère à l’aide d’une technique d’aspiration de micropipette. C’est la seule technique qui permet d’étirer la flexibilité et l’instabilité de la membrane pour être évaluées dans le cas d’expériences simples. Ce protocole implique une série de procédures de la préparation vésicule à l’évaluation mécanique.
Il est très important d’être patient et de résoudre tous les problèmes techniques au fur et à mesure qu’ils surviennent. La visualisation de ces techniques est essentielle pour comprendre comment traiter correctement la surface capillaire et comment effectuer l’étape obligatoire de préstress. Montrant la vésicule sans défauts.
Martin Fauquignon, doctorant au laboratoire travaillant sur le développement de vésicules lipidiques polymères hybrides, fera la démonstration. Avant de commencer la procédure placer les capillaires de micropipette en verre froid verticalement dans les supports. Et baisser les supports jusqu’à ce que les pointes soient immergées dans la solution fraîchement préparée d’albumine de sérum bovin de glucose pendant la nuit.
Le lendemain matin, la solution aurait dû s’élèver d’environ un centimètre dans les pointes par l’action capillaire. À l’aide d’une seringue en verre de 500 microlitres, équipée d’un capillaire flexible en silice fondue, remplissez chaque pipette de la solution de glucose. Ensuite, aspirez la solution de chaque pipette, avant de remplir les pipettes avec une solution de glucose frais plusieurs fois jusqu’à ce que tout le sérum tel qu’il a été enlevé.
Pour préparer une chambre d’électroformation, nettoyez d’abord les glissières ITO avec un solvant organique approprié et identifiez la surface conductrice à l’aide d’un Ohmeter. Fixez les fils électriques sur le côté conductrice de chaque glissière avec du ruban adhésif. Tremper un capillaire dans la solution ampiviale jusqu’à ce qu’environ 5 microlitres de la solution aient été collectés par action capillaire.
Placez le capillaire chargé en contact avec le centre d’une plaque ITO en verre et étalez doucement la solution sur la glissière. Lorsque le solvant s’est complètement évaporé, appliquez la solution deux fois de plus comme il vient de le démontrer. avant d’ajouter une couche de graisse sans silicium des deux côtés de l’espaceur ouvert o-anneau autour de la zone de dépôt.
Ensuite, placez la face conductrice d’une deuxième plaque de verre ITO sur le dessus de l’espaceur, et placez la chambre d’électroformation sous vide pendant 3 heures pour éliminer toute trace de solvant organique. Pour l’électroformation des vésicules unilamellar géantes, branchez les fils électriques dans le générateur. Réglez la fréquence du générateur à 10 Hertz, et l’amplitude à 2 Volts, pic à pic.
Lorsque la tension a été réglée, utilisez une seringue munie d’une aiguille de diamètre intérieur de 0,8 millimètre pour injecter une millilitre de solution de saccharose molaire de 0,1 molaire dans la chambre, et laissez la chambre sous la tension et la fréquence appliquées pendant 75 minutes. À la fin de l’électroformation, éteignez le générateur. Et utilisez la seringue d’un millilitre pour aspirer un petit volume de solution jusqu’à ce qu’une bulle d’air soit produite à l’intérieur de la chambre.
Inclinez légèrement la chambre pour déplacer la bulle dans la chambre et pour aider les vésicules à se détacher de la surface de la glissière. Et aspirer tout le volume de solution dans la seringue. Ensuite, transférez la solution vésicule dans un tube en plastique d’un millilitre.
Pour mettre en place les matériaux pour la micromanipulation, aspirez à créer un flux d’eau, un réservoir d’eau pure, à un seul support. Et appuyez légèrement tout en soulevant le réservoir pour éliminer les bulles d’air, et pour créer une pression positive. Remplir un capillaire enduit de sérum avec une solution de glucose frais jusqu’à ce qu’une goutte se forme à la pointe.
Retirez le tube de seringue du support métallique pour créer un léger débit d’eau à l’extrémité du support, et tournez le capillaire à l’envers pour relier la goutte de glucose au débit d’eau. Ensuite, vissez le capillaire et le support ensemble. Pour positionner la pipette, collez deux glissières en verre à partir d’une scène en aluminium sur mesure ainsi que de la graisse sous vide.
Et installez les diapositives sur une scène de microscope. À l’aide d’une pipette d’un millilitre, former un ménisque entre les deux toboggans avec un glucose molaire de 0,1. Placez la pipette et son support sur l’unité motrice du micromanipulateur.
Serrez le bouton de serrage et utilisez le joystick du panneau de commande en mode grossier. Abaissez la micropipette près du ménisque de glucose. Utilisez le mode fin pour ajuster la position de la pointe au centre du ménisque.
Immerger la pointe dans le glucose pour nettoyer ses surfaces extérieures et intérieures. Après quelques minutes, retirer le capillaire du ménisque et remplacer le glucose par un ménisque frais. Aspirez deux microlitres de vésicules unilamellar géantes dans le saccharose molaire de 0,1, dans une pointe de micropipette de 20 millilitres.
Introduire les vésicules dans le ménisque. Utilisez le microscope pour observer les vésicules au bas de la chambre de diapositives. Lorsque les vésicules sont légèrement dégonflées, réinsérer la pipette d’aspiration et se concentrer sur le bout de la pipette.
Réglez ensuite la hauteur de base du réservoir d’eau à la pression à laquelle le mouvement des particules est arrêté. Entourez le ménisque d’huile minérale pour éviter l’évaporation. Pour effectuer une expérience d’aspiration de micropipette, abaissez la pointe de pipette dans le ménisque.
Créer une petite quantité de pression d’aspiration pour aspirer une vésicule. La membrane de la vésicule sélectionnée doit légèrement fluctuer et ne doit présenter aucun défaut visible. Utilisez le micromanipulateur pour élever la pipette à un niveau plus élevé pour isoler la vésicule aspirée d’autres vésicules.
Abaissez le réservoir d’eau à environ 10 centimètres pour préstresser la vésicule avant de soulever le réservoir pour retourner la pression à la valeur initiale. D’une hauteur de 0,5 centimètre, diminuez lentement la pression d’aspiration jusqu’à ce qu’une pression à laquelle la membrane fluctue soit atteinte. Ensuite, augmenter la pression pour visualiser clairement une langue dans la pointe, la longueur de projection de quelques microns.
Pour déterminer le module de flexion, augmenter la pression d’aspiration, un micromètre à la fois dans le sens inverse. Jusqu’à 0,5 à 0,8 milliNewtons par mètre est atteint. Attendre cinq secondes, et prendre un instantané de la langue après chaque étape.
Pour déterminer la zone de comprimabilité modulus, et la tension de lyse et la souche continuent d’augmenter la pression d’aspiration de 0,5 milliNewtons par mètre jusqu’à ce que la tension de rupture est atteinte. Dans cette expérience représentative, la contrainte de modulus de compressibilité de secteur et de lyse pour POPC étaient en parfait accord avec cela attendu de la littérature. Dans ce tableau, des valeurs typiques pour les polymères obtenus peuvent être observées.
Notez que la dureté de la membrane obtenue à partir de copolymères diblock est beaucoup plus grande que celles obtenues à partir de copolymère tribloc. Fait intéressant, en utilisant le copolymer diblock, il est possible d’obtenir un géant hybride unilamilar lipide polymère vésicules qui démontrent une dureté plus robuste que celle mesurée pour les liposomes. Ce protocole peut être utile pour mesurer la vésicule à l’aide d’une pipette, par exemple, pour mesurer la perméabilité de la membrane par choc asmatique.
Assurez-vous de compléter chaque étape avec rigueur et précision, en particulier lors de la mise en place de la connexion tribune. Cette technique a été exploitée pour comprendre l’origine physique de la fission membranaire, par la mesure de la tension de la ligne aux limites principales dans les vésicules modifiées.
