Ce protocole démontre une boîte de culture cellulaire à microtexture conçue pour la croissance de centaines d’organoïdes ayant une connaissance du matériel et entièrement compatible avec la microscopie. Notre technique permet efficacement de générer des milliers d’organoïdes, entièrement compatibles avec l’imagerie à long terme et la culture cellulaire à long terme. Ce protocole présente un grand intérêt pour les applications biomédicales telles que le pipeline de dépistage de médicaments et les domaines de recherche sur le cancer.
La technique présentée dans ce protocole est facile à maîtriser après quelques tentatives par toute personne ayant de l’expérience avec les procédures de laboratoire et la microscopie optique. Pour commencer, coupez de petites portions du moule PDMS à la dimension requise pour le dispositif final. Coupez-les parallèlement aux directions XY du tableau.
Placez l’un des dés PDMS préparés face vers le bas sur la section PDMS plate. Ensuite, à l’aide d’une pipette, ajoutez environ 0,1 à 0,2 millilitre d’adhésif durcissable aux UV sur un côté du moule. Suivez la progression du liquide à l’intérieur de la cavité à l’aide d’un microscope optique inversé à un grossissement de 10X.
Exposez l’adhésif à la lumière UV pour le durcir. Ajustez le temps d’exposition en fonction de la densité de puissance de la source UV telle que décrite dans le manuscrit texte. En utilisant la quantité excessive d’adhésif sur un bord, maintenez l’adhésif durci sur le substrat plat PDMS en appuyant doucement avec un doigt.
Pendant ce temps, à l’aide d’une pince à épiler, pincez un coin du moule à côté du même bord maintenu et décollez lentement le moule, tout en vous assurant que le film texturé n’est pas soulevé. Coupez l’excès d’adhésif et le substrat PDMS à l’aide d’une lame de rasoir pour laisser la couche durcie, texturée et adhésive à plat sur le PDMS avec l’excès de substrat sur un seul bord. Traiter une lamelle de couverture propre avec un procédé plasma à oxygène court pour améliorer son hydrophilie.
Après l’activation du plasma, essorez la fine couche d’adhésif durcissable aux UV en plaçant le couvercle sur le mandrin sous vide d’un enduit de spin standard et en versant une petite goutte d’adhésif au centre du couvercle. Exécutez le processus de revêtement par essorage tel que décrit dans le manuscrit texte. Si le revêtement d’essorage n’est pas disponible, déposez environ 0,1 millilitre d’adhésif durcissable aux UV sur une lamelle de couverture propre à l’aide d’une pipette.
Prenez un deuxième bordereau de couverture et placez-le sur le premier pour que l’adhésif liquide se répartisse uniformément entre les deux lamelles de couverture. Une fois que l’adhésif a atteint le bord des lamelles de couverture, séparez-les doucement en les faisant glisser l’une sur l’autre. Une fois séparés, les deux lamelles de recouvrement seront entièrement recouvertes d’une fine couche d’adhésif liquide.
Après le revêtement par essorage, prédurcir l’adhésif par exposition aux UV. Ajustez le temps d’exposition en fonction de la densité de puissance de la source UV utilisée. Prenez l’un des films texturés et placez-le en contact avec le couvercle enduit d’adhésif. Assurez-vous que le contact entre l’adhésif partiellement durci et le film texturé est aussi uniforme que possible.
À ce stade, l’adhésif sur le couvercle doit être suffisamment solide pour éviter la refusion et le contact peut être optimisé en appuyant doucement sur le couvercle. Exposez les lamelles de couverture à la lumière UV jusqu’à ce que la couche adhésive enduite soit complètement durcie. Cela scellera le film texturé sur la lamelle de couverture et fournira une isolation étanche entre les cavités périmétriques.
Ensuite, à l’aide d’une pince à épiler, pincez le PDMS au bord où l’excès de matière a été laissé après la coupe et décollez le substrat plat PDMS. Cette étape permet à la couche de film texturé d’adhérer à la lamelle de couverture avec un accès ouvert en haut pour l’ensemencement cellulaire. Avant l’ensemencement cellulaire, sur un dispositif passivé avec un copolymère biométrique tel que décrit dans le manuscrit, distribuer un millilitre de PBS stérile dans les boîtes de Petri de culture cellulaire de 35 millimètres.
Dégazer la capsule avec du PBS stérile en utilisant la chambre à vide pendant 10 minutes, suivie de plusieurs tours de pipetage pour éliminer toutes les bulles. Remplacez le PBS par un milieu de culture stérile et stérilisez la plaque avec de la lumière UV pendant 30 minutes sous une hotte de culture cellulaire. Préparer une suspension cellulaire en suivant les recommandations de trypsinisation ou de préparation de suspension cellulaire pour les cellules d’intérêt telles que décrites dans le manuscrit.
Comptez et ajustez la concentration cellulaire à 500 000 cellules par millilitre dans le milieu de culture cellulaire recommandé. Retirez le tampon PBS de la boîte de culture cellulaire de 35 millimètres, puis distribuez un millilitre de la suspension cellulaire ajustée. Replacez la capsule de culture cellulaire dans l’incubateur cellulaire pendant 10 minutes.
Environ 80 à 100 cellules pénètrent dans chaque cavité périmétrique. Après environ 10 minutes d’incubation, récupérez la boîte de culture cellulaire de l’incubateur et aspirez doucement la suspension cellulaire pour éliminer les cellules non piégées. Ajoutez un millilitre de milieu de culture à la boîte de culture et replacez-le dans l’incubateur cellulaire.
En option, pour récupérer les organoïdes après leur croissance dans les puits, pincez la couche adhésive texturée sur le bord coupé à l’aide d’une pince à épiler et décollez-la doucement de la lamelle de verre, mais gardez-la immergée dans le milieu. L’augmentation de la concentration de copolymère biométrique a augmenté l’épaisseur du revêtement. Le dégazage complet des boîtes de culture cellulaire était essentiel pour éliminer les bulles d’air piégées dans les cavités périmétriques.
Les organoïdes se sont formés après les deuxième et 15e jours de culture. La microscopie confocale à disque rotatif a montré des images représentatives des organoïdes et une reconstruction 3D. Lors de la préparation du plat de culture, il est important de faire attention à l’assemblage du moule ou de la pile de substrat et d’assurer un bon contact entre le film texturé et la lamelle de couverture.
Le confinement fourni par nos microcavités et l’absence de perte matérielle ont attiré l’attention des chercheurs en biologie spatiale intéressés par l’étude de l’effet de la microgravité sur l’homéostasie organoïde.
