La méthode visualise et quantifie la capacité des cellules cancéreuses à délaminer et à envahir, permettant ainsi d’évaluer leur agressivité métastatique avant la formation de l’action ou la métastase. Que la notation est basée sur le processus de délamination comme condition préalable à la formation de métastases, obtenant ainsi des informations sur l’agressivité métastatique des cellules d’une manière relativement rapide, facile et bon marché. Pratiquez d’abord les différentes étapes individuelles avant de commencer l’expérience proprement dite.
Le test CAM-Delam comprend plusieurs étapes techniques difficiles à expliquer par écrit et beaucoup plus faciles à apprécier et à apprendre par démonstration visuelle. Pour commencer, placez le nombre souhaité d’œufs dans des plateaux à œufs et incubez les œufs de poussin horizontalement dans un incubateur à œufs. Stérilisez ensuite 30 bateaux de pesage et 30 petites boîtes en plastique avec des bouchons transparents en pulvérisant de l’éthanol à 70%.
Ensuite, séchez les bateaux de pesage et les boîtes dans une hotte laminaire pendant la nuit et conservez-les dans une boîte en plastique fermée jusqu’à ce qu’ils soient utilisés le troisième jour d’incubation. Stérilisez deux litres d’eau distillée ou désionisée pour 30 œufs incubés, deux paires de ciseaux et trois paires de pinces. Tout d’abord, ajoutez environ 50 millilitres d’eau stérilisée aux boîtes en plastique stérilisées et fermez les couvercles.
Le troisième jour d’incubation, cassez la coquille de l’œuf à l’aide de la partie tranchante des ciseaux et coupez une ouverture droite dans la coquille. Après avoir ouvert la coquille d’œuf manuellement sur un bateau de pesée, collectez le blanc d’œuf, le jaune et il est attaché embryon sain dans le bateau de pesée. Ensuite, recherchez un embryon intact avec un cœur battant, un jaune intact et des vaisseaux sanguins développés pour l’expérience.
Ensuite, transférez doucement le bateau de pesage dans une chambre humidifiée interne et incubez la chambre humidifiée interne dans l’incubateur à œufs. Pour préparer des anneaux en silicone, coupez un tube en silicone d’un diamètre intérieur et extérieur de quatre millimètres et cinq millimètres respectivement dans une épaisseur d’environ un millimètre, de préférence à l’aide d’un coupe-papier. Transférez ensuite les anneaux en silicone dans de petites bouteilles en verre.
Couvrez-les avec une feuille de métal et stérilisez-les à l’aide d’un autoclave ou similaire. Conservez les anneaux de silicone stériles à température ambiante. Cultiver les lignées cellulaires cancéreuses d’intérêt dans le milieu de culture pertinent en culture cellulaire.
Ensuite, préparez un millilitre de mélange RPMI de collagène et conservez-le sur la glace. Ensuite, essayez les cellules cancéreuses pour isoler les cellules en retirant d’abord le milieu de culture cellulaire et en les lavant. Ajoutez ensuite trois millilitres de solution de trypsine par boîte de culture cellulaire de 15 centimètres de diamètre et incubez pendant deux à trois minutes dans un incubateur de culture cellulaire jusqu’à ce que les cellules se détachent.
À l’aide d’un microscope inversé de table, voir les cellules détachées. Ensuite, inactivez la trypsine en ajoutant cinq millilitres de milieu RPMI complet à chaque boîte de culture cellulaire et collectez la suspension cellulaire de toutes les boîtes de culture cellulaire dans un tube de 50 millilitres. Pour compter les cellules cancéreuses, ajoutez 10 microlitres de la suspension cellulaire à 10 microlitres de tache bleue de trypan à 0,4%.
Après avoir mélangé l’échantillon en pipetant de haut en bas plusieurs fois, chargez 10 microlitres du mélange cellulaire par chambre dans la lame de l’échantillon dans le compteur de cellules. Ensuite, centrifugez la suspension de culture cellulaire de volume correcte dans un tube de 50 millilitres à 500 fois G pendant cinq minutes. Après avoir jeté le surnageant, mélanger la pastille cellulaire avec un millilitre du mélange RPMI de collagène.
Une fois que les cellules sont mélangées avec une pipette d’un millilitre, gardez la suspension cellulaire préparée sur de la glace. Le jour d’incubation 10, sortez les chambres internes humidifiées avec les œufs incubés sans coquille de l’incubateur. Après avoir ouvert la chambre humidifiée interne, placez jusqu’à six anneaux en silicone sur le CAM à l’aide de pinces stérilisées.
Une fois que la suspension de cellules cancéreuses est mélangée par pipetage pour obtenir une distribution uniforme des cellules cancéreuses, ajoutez 20 microlitres de la suspension de cellules cancéreuses préparée à l’intérieur d’un anneau de silicone. Après avoir fermé la chambre humidifiée interne, mettez-la dans l’incubateur à œufs. Après 14 heures, 1,5 jour, 2,5 jours et 3,5 jours d’incubation, sortez environ sept chambres internes humidifiées tout en ouvrant leurs couvercles un à la fois.
Avec une paire de ciseaux, disséquez les cellules cancéreuses cultivées attachées au CAM en coupant à l’extérieur de l’anneau de silicone. Ensuite, transférez immédiatement l’échantillon cam-Delam isolé à l’aide d’une pince à 4% de paraformaldéhyde dans un tampon de phosphate molaire de 0,1 dans une boîte de Pétri pour la fixation du tissu et maintenez-le sur la glace ou à quatre degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, retirez la solution de paraformaldéhyde à 4% et ajoutez 30% de saccharose dans un tampon de phosphate molaire de 0,1 aux échantillons CAM-Delam et équilibrez à quatre degrés Celsius pendant une heure.
Sous un microscope à dissection, retirez soigneusement l’anneau en silicone à l’aide d’une pince. Ensuite, coupez l’échantillon CAM-Delam dans une forme rectangulaire avec les cellules cancéreuses au milieu à l’aide d’une paire de ciseaux. Ensuite, transférez les échantillons CAM-Delam dans un milieu de section congelé dans une boîte de Pétri pour éliminer l’excès de saccharose, puis incorporez des moules dans un milieu de section congelé avec une paire de pinces.
Sous un microscope à dissection, positionnez l’échantillon CAM-Delam en forme de U dans une réaction verticale dans les moules d’encastrement à l’aide de n’importe quel instrument en forme d’aiguille et stockez les échantillons CAM-Delam à 80 degrés Celsius. Ensuite, coupez les échantillons CAM-Delam congelés à 10 micromètres sur cinq à six lames consécutives en utilisant la cryosection. Tout d’abord, faites une ligne avec un marqueur hydrophobe sur les diapositives où les sections se terminent et laissez-les sécher pendant quelques minutes.
Placez ensuite les lames dans une chambre humidifiée et couvrez les sections avec environ 200 à 500 microlitres de solution bloquante et incubez pendant 15 à 30 minutes. Après avoir versé la solution bloquante, remplacez-la par 100 à 150 microlitres de l’anticorps primaire d’intérêt dilué dans la solution bloquante et incubez pendant la nuit à quatre degrés Celsius. De même, après avoir versé la solution d’anticorps primaire, transférer les lames dans les cuvettes en verre et laver au moins trois fois pendant cinq minutes chacune dans tbST.
Ensuite, retirez l’excès de TBST de la lame et de la zone de barrière hydrophobe avec un mouchoir en papier souple et couvrez la lame avec 100 à 150 microlitres d’un anticorps fluorescent secondaire approprié dilué dans une solution bloquante combinée à DAPI. Incuber la lame dans l’obscurité à température ambiante pendant une heure. Après avoir versé la solution d’anticorps secondaire, transférer les lames dans les cuvettes en verre et laver au moins trois fois pendant cinq minutes chacune dans tbST.
Retirez ensuite l’excès de TBST de la glissière et de la zone de barrière hydrophobe avec un mouchoir en papier souple. Ensuite, montez les glissières en mettant une à deux gouttes de support de montage fluorescent sur la glissière et placez doucement un couvercle en verre tout en évitant les bulles d’air. Photographiez les sections à l’aide d’un microscope à épifluorescence équipé d’un appareil photo numérique, de préférence à un grossissement de 10 X et analysez les sections à l’aide des catégories de notation CAM-Delam suivantes décrites dans le manuscrit.
L’utilisation de chambres humidifiées internes a considérablement amélioré le taux de survie des embryons de poussins de moins de 50% à 90% au jour d’incubation 10 et d’environ 15% à 80% au jour d’incubation 13. Les résultats montrent que la capacité des cellules cancéreuses à dégrader la lame basale et à envahir le mésenchyme peut être classée en quatre catégories, y compris la lame basale intacte sans altérations visibles, la lame basale altérée mais non endommagée, la lame basale endommagée sans invasion cellulaire et la lame basale endommagée avec invasion cellulaire. La coloration des anticorps contre le facteur de von Willebrand montre que le CAM a également été épaissi avec une augmentation de la formation de vaisseaux sanguins lorsque les cellules cancéreuses ont causé une lame basale altérée ou endommagée.
Cependant, aucun de ces deux phénotypes n’a été observé lorsque le CAM était intact. Les cellules PC-3U ont induit une laminine endommagée après 1,5 jour avec une invasion claire après 2,5 jours. En revanche, les cellules U251 n’ont induit que des altérations mineures de la laminine après 1,5 à 3,5 jours, mais n’ont jamais causé de dommages visibles à la laminine.
Après un traitement au chlorure de cobalt, les cellules cancéreuses non métastatiques U251 ont acquis la capacité d’induire la délamination et les cellules invasives, qui ont été supprimées lorsqu’elles étaient combinées avec l’inhibiteur MMP, GM6001. Ne pas endommager le CAM avec la pointe de la pipette lors de l’ensemencement des cellules cancéreuses, car de tels dommages à la membrane détruiront les lectures du test. Une possibilité future est d’optimiser la méthode CAM-Delam pour déterminer les propriétés métastatiques dans les échantillons de tumeurs cliniques, ce qui pourrait à l’avenir compléter la stadification des métastases ganglionnaires tumorales utilisée aujourd’hui.
