Le but de ce protocole est de générer une ligne de mouche éditée endogène. Nous montrons un knock-in de protéine fluorescente à titre d’exemple, mais il pourrait également être appliqué à d’autres knock-in, knock-out, ainsi qu’à la génération de mutations. Notre protocole est une méthode basée sur la recombinaison homologue CRISPR, il n’y a donc presque aucune restriction sur les sites de mutation.
De plus, notre protocole a considérablement réduit le temps et les efforts nécessaires aux étapes de génotypage. Pour commencer, ouvrez le site Web CRISPR pour concevoir des ARNsg pour la drosophile et entrez environ 100 séquences de paires de bases autour de l’emplacement d’insertion souhaité. Sélectionnez les cibles CRISPR avec l’option de guanine à cinq primes.
Cliquez sur le bouton Trouver des cibles CRISPR pour générer une liste de séquences d’ARNsg possibles. Cliquez ensuite sur le bouton d’évaluation pour chaque séquence et choisissez deux ARNsg qui n’ont aucune cible hors cible. Étant donné que les niveaux d’expression des protéines naturelles sont généralement beaucoup plus faibles, sélectionnez des marqueurs fluorescents qui sont brillants et photostables, et qui correspondent à la configuration expérimentale.
Ensuite, concevez un agent de liaison pour relier les étiquettes d’épitopes au marqueur fluorescent pour l’analyse biochimique. Utilisez un peptide de liaison allant de deux à 20 acides aminés, comprenant des acides aminés comme la glycine et la sérine. Pour concevoir le vecteur donneur de la drosophile, organiser la séquence d’ADN du peptide de liaison et de l’étiquette fluorescente, et s’assurer que les séquences homologues flanquent les deux extrémités.
Modifiez toutes les séquences PAM dans le plasmide donneur pour maintenir la séquence d’acides aminés des protéines résultante. Ensuite, positionnez les codons de début et d’arrêt en fonction de l’emplacement de la balise. Pour le marquage interne, assurez-vous que l’étiquette fluorescente est dans le cadre de la séquence codante du gène cible.
Pour le marquage N-terminal, positionnez l’étiquette fluorescente après le codon de départ endogène. Pour le marquage C-terminal, placez l’étiquette fluorescente avant le codon stop naturel. Assurez-vous de ne conserver qu’un seul codon de départ pour éviter les problèmes de traduction potentiels.
Utilisez l’approche alternative de clonage basée sur les enzymes de restriction pour insérer la séquence d’ARNsg dans le plasmide plasmide U6 Bbs1-chiRNA. Après avoir créé le plasmide d’ARNsg, transformez-le en DH5-Alpha Escherichia coli selon les instructions du fabricant. Vérifiez les clones résultants par séquençage de Sanger, en utilisant des amorces de séquençage standard T3 ou T7.
Pour créer le plasmide donneur, utilisez de l’ADN double brin avec la séquence souhaitée et intégrez-le dans le site de clonage multiple négatif du plasmide Bluesript 2SK. Séquencez le plasmide du donneur pour vous assurer que les séquences d’ARNsg ou de PAM sont correctement modifiées et qu’il n’y a pas de SNP présents dans le plasmide. Ensuite, prenez des mouches Cas9 injectées avec l’ARNg construit et les plasmides donneurs.
Anesthésier les mouches avec du dioxyde de carbone et séparer les mouches mâles et les femelles vierges. Pour établir des croisements de mouches, appariez chaque mâle G zéro avec au moins deux femelles vierges FM7L dans des flacons alimentaires CT étroits individuels. Placez les flacons croisés dans un incubateur ventilé maintenu à 25 degrés Celsius et 60 % d’humidité jusqu’à ce que les mouches F1 se ferment.
Ensuite, anesthésier et recueillir au moins 10 descendants femelles vierges issus de croisements mâles et femelles G zéro. Assurez-vous que chaque mouche F1 est étiquetée avec les détails de sa filiation et stockée séparément. Pour dépister les mouches pour la PCR, concevez des amorces avec une température de fusion d’environ 55 degrés Celsius qui englobent le site d’édition du gène cible.
Préparez un tampon de lyse pour chaque échantillon de mouche et distribuez 10 microlitres dans chaque puits d’une plaque PCR de 96 puits. Maintenez le tampon à une température froide pendant le processus de dissection de la jambe. Ensuite, préparez des tubes capillaires en verre, en remplissant une extrémité de nourriture à base de gélose saccharose.
Placez ces tubes dans une plaque de puits de 96 puits de profondeur, appelée l’hôtel à mouches. Pour le curage des jambes, placez le tampon d’anesthésie au dioxyde de carbone sous un stéréomicroscope. Anesthésie une mouche candidate et sectionne l’une de ses pattes centrales.
Après cela, plongez la jambe dans le tampon de lyse. Tenez l’aile de la mouche avec une paire de pinces métalliques fines. Déplacez la mouche vers l’hôtel à mouches et scellez immédiatement le tube avec du fil.
Hébergez l’hôtel dans un incubateur ventilé maintenu à 25 degrés Celsius et 60% d’humidité. Immerger les jambes coupées dans la solution tampon de lyse dans un thermocycleur. Organisez la réaction PCR selon les instructions du fabricant, en utilisant 1,5 microlitre de lysat de patte de mouche comme source d’ADN.
Soumettre les produits de PCR à l’électrophorèse sur gel d’agarose et interpréter les résultats en fonction de la taille de la bande. Sur la base des résultats du gel, sélectionnez les mouches positives de l’hôtel de mouches et croisez-les individuellement avec des mouches d’équilibrage pour produire la génération F2. Utilisez des stocks homozygotes pour le séquençage Sanger du site d’édition afin d’assurer la précision.
Rétrocroisez des lignes de mouche validées avec des mouches de type sauvage pour éliminer les mutations de fond. Criblez chaque génération à l’aide du protocole PCR à jambe unique. Des images au microscope confocal de cerveaux de drosophiles adultes ont montré des protéines menstruelles organisées en foyers nucléaires discrets tout au long de la nuit et tôt le matin.
Dans l’ensemble, ce protocole est robuste si vos amorces de génotypage PCR sont spécifiques.
