Cette méthode facilitera la recherche sur la reproduction sexuée chez Arabidopsis en permettant l’observation des interactions des gamétophytes avec une grande efficacité et un nombre élevé d’échantillons par séance d’imagerie. Le principal avantage de cette technique est qu’en maintenant les ovules sur le septum, la quantité et la réceptivité des ovules sont considérablement augmentées par rapport aux méthodes précédentes. La technique de dissection peut être difficile au début et nécessite une main ferme.
Par conséquent, il est recommandé de pratiquer quelques fois sur des pistils émasculés avant de commencer l’expérience. Commencez par préparer le milieu de germination du pollen comme expliqué dans le texte. Une fois la gélose complètement fondue, pipeter 130 microlitres du milieu dans le puits de 14 millimètres d’un plat à fond en verre de 35 millimètres.
Faire pivoter le plat jusqu’à ce que le milieu recouvre le puits. Aspirer 40 microlitres de milieu à partir du centre du plat à l’aide d’une pipette, en laissant derrière lui 90 microlitres de milieu. Pour assurer un refroidissement uniforme du milieu, refroidissez le plat sur un bloc d’aluminium dans une chambre d’humidité avant de stocker les plaques à quatre degrés Celsius pendant la nuit.
Le matin avant l’imagerie, choisissez des plantes saines d’Arabidopsis qui ont récemment commencé à produire comme donneurs de septum et donneurs de stigmatisation. Enlevez les fleurs plus âgées sur l’inflorescence avant d’émasculer les fleurs donneuses de septum 12B à trois stades et les fleurs donneuses de stigmate de stade 12B de stade 12B en enlevant leurs étamines, sépales et pétales. Le matin, 24 heures plus tard, pollinisez les donneurs de stigmatisation avec les fleurs donneuses de pollen qui libèrent facilement le pollen.
La pollinisation est complète lorsque les stigmates sont presque entièrement recouverts de pollen. 30 minutes après la pollinisation, retirez un pistil de donneur de septum sain et mature au pédicule et placez-le dans du ruban adhésif double face frais monté sur une lame de verre avec le stigmate collé juste à côté du bord du ruban. Épinglez solidement le pistil sur la bande en appuyant doucement sur le pédicule et le long de l’ovaire à l’aide de l’arrière d’une nouvelle aiguille de seringue à insuline.
Enlevez les débris de sépale, de pétale et d’étamine restants de l’émasculation. Sous un stéréoscope, utilisez une aiguille de seringue à insuline pour faire deux coupures par carpelle à la jonction style-ovaire et à la jonction ovaire-pédicule. Ensuite, faites des coupures peu profondes le long du septum de chaque carpelle et décollez les parois ovariennes sur la bande, exposant ainsi les ovules.
Glissez doucement l’aiguille entre les deux septa pour couper le replum sur toute la longueur du pistil sans déranger les ovules. Ensuite, coupez le septum supérieur près du style afin que le septum entier se décolle. Ensuite, retirez le septum du pédicule à l’aide d’une pince.
Placez le septum aussi plat que possible sur le milieu avec les micropiles des ovules tournées vers le haut. Appuyez ensuite doucement sur le septum jusqu’à ce que les ovules soient légèrement incrustés dans le milieu. Placez les pistils pollinisés du donneur de stigmate sur du ruban adhésif frais double face monté sur une lame de verre de manière à ce que la jonction de type ovaire soit hors du bord de la bande.
Coupez le style directement à l’aide d’une lame de rasoir et soulevez-le avec le stigmate attaché à la lame. Retirez le stigmate de la lame avec une aiguille de seringue à insuline et placez-le à plat à environ 250 à 300 micromètres des ovules. Transférez jusqu’à 12 stigmates, en en plaçant deux de chaque côté de chaque septum.
Après incubation dans une chambre d’humidité au microscope maintenue à 92% d’humidité relative à 21 degrés Celsius, la boîte est prête pour l’imagerie. Faites la mise au point des échantillons sous fond clair à une faible intensité lumineuse, puis passez à la lumière fluorescente. Ensuite, marquez les zones de l’échantillon sur la vue d’ensemble de la scène à imager.
Une fois cela fait, commencez l’imagerie à l’aide d’un schéma d’acquisition à plusieurs étapes avec une fonction de mise au point automatique au début de chaque zone de vue d’ensemble. Environ sept à neuf heures après l’incubation, vérifiez que les tubes polliniques ont été attirés et reçus par les ovules. Une réception réussie du tube pollinique montre une explosion explosive du tube pollinique dans le microtas des ovules.
Lorsque vous avez terminé, arrêtez l’acquisition. Huit répétitions techniques de la méthode des ovules semi-in vitro excisés ont été réalisées et notées pour une réception réussie du tube pollinique. Les carrés verts montrent une réception réussie et les carrés rouges montrent une réception défectueuse.
Ces expériences ont révélé qu’environ 28% des ovules présentent un éclatement explosif du tube pollinique, ce qui a entraîné une efficacité allant d’environ 10 à 50%En utilisant la méthode semi-in vitro cum septum, beaucoup plus d’ovules d’ales ont pu être notés et jusqu’à 40 cas de réception réussie du tube pollinique ont été enregistrés en une séance d’imagerie, comme on le voit dans les ovules avec des carrés verts. Cinq répétitions techniques de cette méthode ont montré qu’environ 79% des ovules attirant les tubes polliniques présentent un éclatement explosif du tube pollinique, ce qui entraîne une efficacité allant d’environ 70 à 100% Lors de la rupture du tube pollinique, on a observé que le noyau de la synergide réceptive se dégradait en même temps avec une résolution d’une minute. Après la karyogamie, la migration du noyau de l’ovule vers la micropile a été observée.
Les synergies gauche et droite ont pu servir de synergie réceptive. Les facteurs critiques à prendre en compte pour le succès de cette méthode sont la mise en scène, l’utilisation d’un milieu fraîchement préparé, l’encastrement des ovules dans le milieu, le maintien d’une humidité élevée et la faible phototoxicité. On peut également coupler cette technique avec l’imagerie d’excitation à deux photons pour une observation plus approfondie des changements physiologiques et cytologiques qui se produisent lors des interactions entre gamétophytes.
On peut également coupler cela avec la microscopie électronique en fixant les ovules.
