Decellularization של הלב האנושי כולו בתוך נרתיק מווסת בכיוון הפוך

Summary

שיטה זו מאפשרת decellularization של איבר מוצק מורכבים באמצעות פרוטוקול פשוט המבוסס על שוק אוסמוטי זלוף של יונית סבון עם הפרעה מטריצות איבר מינימלי. היא כוללת טכניקה decellularization הרומן מלב אנוש בתוך נרתיק מווסת עם ניטור בזמן אמת זרימה dynamics וסלולר יצוא פסולת.

Abstract

הפתרון האולטימטיבי עבור חולים עם אי ספיקת לב בשלב הסופי הוא ניתוח השתלה. אבל תורם לבבות מוגבלים, החיסוני נדרש, בסופו של דבר דחייה יכולה להתרחש. יצירת פונקציונלי, לב ביו-מלאכותי עצמיים יכול לפתור אתגרים אלה. Biofabrication מלב מורכבת לגרדום ותאים היא אפשרות אחת. לפיגום טבעי עם הרכב רקמות ספציפיות, כמו גם מיקרו-מאקרו-אדריכלות ניתן להשיג על ידי לבבות decellularizing של בני אדם או חיות גדולות כמו חזירים. Decellularization כרוך שוטף פסולת הסלולר תוך שימור מטריצה חוץ-תאית תלת-ממד של להערכת ומאפשר "cellularization"-timepoint מאוחר יותר. ניצול את הרומן שלנו למצוא את decellularization זלוף של איברים מורכבים אפשרי, אנחנו פיתחנו שיטה "פיזיולוגיים" יותר decellularize לבבות אנושיים שאינם שיפותחו על-ידי הצבתם בתוך נרתיק מווסת, ב הפוך כיוון, תחת לחץ מבוקר. המטרה של שימוש נרתיק בלחץ היא ליצור לחץ מעברי צבע על פני שסתום אבי העורקים שיישאר סגור ושיפור זלוף שריר הלב. הערכה בו זמנית של דינמיקת זרימת פסולת הסלולר הסרת במהלך decellularization אפשרה לנו לעקוב אחר תזרים נוזלים וגם יצוא פסולת, ובכך יוצר לפיגום שניתן המשמש לתיקון הלב פשוט (למשל ככתם או שסתום לגרדום) או בדומה לפיגום איברים שלמים.

Introduction

אי ספיקת לב מוביל תמותה גבוהה בחולים. אפשרות הטיפול האולטימטיבי עבור אי ספיקת לב בשלב הסופי הוא מאפשר-השתלת. עם זאת, יש רשימת המתנה ארוכה עבור השתלת בשל המחסור תורם איברים, חולים הפנים שלאחר השתלת hurdles שנעים בטווח שבין החיסוני חיים ארוך ל עוגב כרונית דחייה^1,2. הלבבות פונקציונלי בביו-הנדסה לאכלס מחדש decellularized לבבות בגודל של האדם עם עצמו של החולה תאים יכול לעקוף מכשולים אלה³.

צעד חשוב "הנדסה" הלב הוא הקמת לפיגום עם מבנה כלי הדם ואת parenchymal המתאים, הרכב ותפקוד להנחות את היישור וארגון של תאים למשלוח. בנוכחות המסגרת המתאימה, תאים נזרע על הגרדום צריך לזהות את הסביבה ולבצע הפונקציה הצפוי כחלק האיבר הזה. לדעתנו, מטריצה חוץ-תאית איברים decellularized (dECM) כוללת את המאפיינים הדרושים של לגרדום אידיאלי.

על ידי ניצול להערכת מהותי, מורכב כולו אורגן decellularization יכולה להיות מושגת באמצעות תמיסה לשיתוק או זלוף רטרוגרדית⁴ כדי להסיר את מרכיבי התא תוך כדי שמירה על עדין מטריצה חוץ-תאית 3D ולהערכת^{2, 5,6,7}. להערכת תפקודית חשוב בביו-הנדסה כל האיברים רק ויוו, חלוקת מזון, פינוי פסולת⁸. זלוף כלילית decellularization הוכח כיעיל ביצירת לבבות decellularized חולדות⁴או חזירים^{4,7,9,10,11 12, ,13}ו בני^5,7,14,15,16. ובכל זאת, שלמות של המסתמים, אטריה אזורים "דק" אחרים עלולים לסבול.

ניתן להשיג לב decellularized בגודל אדם פיגומים חזירים באמצעות הלחץ הבקרה^7,9,10,11,12 או אינפוזיה תזרים קצב שליטה^{13, 17} מתורמים האנושי באמצעות לחץ לשלוט^5,7,14,15. Decellularization לבבות אדם התורם מתרחשת במשך 4-8 ימים בלחץ נשלטת על 80-100 מ מ כספית התמצאות זקוף^5,15,16 או במשך 16 ימים בלחץ נשלטת על 60 מ מ כספית¹⁴ . תחת תמיסה לשיתוק, שבשליטת הלחץ decellularization, כשירות שסתום אבי העורקים ממלא תפקיד מכריע בשמירה על יעילות זלוף כלילית ובלחץ יציב בספריית הבסיס של אבי העורקים. העבודות הקודמות שלנו גילה כי הכיוון של הלב השפעות ביעילותה זלוף כלילית במהלך ההליך decellularization ולכן שלמות לגרדום ב סוף⁹.

כהמשך של העבודה הקודמת שלנו⁹, אנחנו מציגים קונספט שבו נרתיק דמוי קרום הלב נוסף כדי לשפר את decellularization לב-שלם. אנו מתארים את decellularization של לבבות אדם הניח בתוך שקיות מווסת, בכיוון הפוך, ותחת לחץ מבוקר-120 מ מ כספית בסיס אב העורקים. פרוטוקול זה כולל ניטור פרופיל זרימה של אוסף המדיה יצוא לאורך כל ההליך decellularization כדי להעריך את יעילות זלוף כלילית והסרה פסולת תא. מבחני הביוכימי מבוצעות ואז לבחון את יעילות השיטה.

Protocol

כל הניסויים דבקה הנחיות ועדת האתיקה ממכון הלב טקסס.

1. איבר הכנה

הערה: בשיתוף פעולה עם LifeGift, ארגון הרכש איברים ללא מטרות רווח בטקסס (http://www.lifegift.org), תרם לבבות אנושיים שאינם מתאימים להשתלה שימשו למחקר בהסכמת שאושרו.

1. להשיג לבבות, דרך הווריד להשרות 30,000 הפארין U לליבם. באופן מאובטח תפר בצינורית הלב באבי העורקים ולצרף קו זלוף בחוזקה. לנקב הכלילי התחתון (IVC) לפרוק את הלב הנכון. חותכים את וריד ריאתי עליון שמאל או הפרוזדור השמאלי לפרוק הצ'יימברס השמאלי של הלב.
2. להשרות 1 ליטר של הלב או heparinized מלוחים. לנתח סניפים קשת אבי העורקים, הווריד הנבוב העליון (SVC), אחרים הוורידים ריאתי כדי לשחרר את הלב של כל קובץ מצורף רקמה וסקולרית או שמסביב. להטביע את הלב היטב heparinized בתמיסת קר.
3. בדוק את הלב האנושי שנתרמו (הן anteriorly והן posteriorly, איור 1). מקום בלב על מגש ויבתר ולבדוק עבור כל נזק או מומים אנטומיים. אם הכבד או הריאות היו רכש עבור השתלת, הלב יכול להציג עם קצר הכלילי ו/או העדרו של שמאל פרפור הקיר האחורי.
4. לבצע בדיקה פנימית פגמים אפשריים - פרוזדורים פגם במחיצה הבין-פרוזדורית (ASD), פגם במחיצה הבין-חדרית (VSD) או מום שסתום (אבי העורקים, ריאות, המסתם הדו-צניפי, התלת-צניפי).
5. אם קיים פגם במחיצה הבין-פרוזדורית, לתקן אותה עם התפרים המתאים (איור 2 א, 2 ב). התיקון של פגמים במחיצה הבין-פרוזדורית נחוץ כדי לעקוב אחר ההתקדמות decellularization באמצעות מדידת עכירות יצוא עורק הריאה (PA). תיקון פגם במחיצה הבין-פרוזדורית מסיר משמאל המחלף הנכון, ומכאן, זרימה החוצה מן הרשות הפלסטינית מייצג זרימה החוצה זרימת הדם בעורק הכלילי דרך הסינוס התקף לב.
6. מאתרים ומפסיקים הנבוב לכוחו של 2-0 בתפר משי (איור 2C).
7. לנתח העורקים (Ao) מן הרשות המרכזית (איור דו-ממדי) עבור תעלות עוקבות.
8. להוסיף מחברים, המבוסס על הקוטר של כלי השיט, (איור 3) אל אאו והרשות ולאבטח אותם בתפרים משי 2-0 (איור 4A).
9. הוספת קו צינורות דרך אטריום שמאל (איור 4B) וכלפי החדר השמאלי (LV) (איור 3), שימוש באחת פתחי וריד ריאתי.
10. להתחבר קו אינפוזיה המחבר ממוקמת ב- Ao ובין הקו יצוא האחד בשטחי הרשות (איור 3).
11. מקם את הלב מוכן לתוך נרתיק פוליאסטר בכיוון ההפוך (הפוך).
12. מקם את התיק עם הלב לתוך מיכל זלוף, סגור את המכסה (איור 4C).
13. להתחבר כל אחת השורות היציאות המתאימות פקק הגומי (מבוסס על הקוטר של מיכל) ולהוסיפו ל מכסה המכולה זלוף כדי לסגור את התיק פוליאסטר (4C איור , איור 5B).
14. Perfuse 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) (136 מ"מ NaCl, מ מ 2.7 אשלגן כלורי, 10 מ מ נה₂HPO₄ ו- 1.8 מ מ ח'₂PO₄ במים מזוקקים, pH 7.4) באמצעות יציאת אינפוזיה של פקק הגומי כדי לוודא יצוא של הרשות הפלשתינית, מהקו מוכנס לתוך LV.
15. השתמש זרם זה כדי לנקות את האיבר של עקבות דם להערכת שיורית. אם לא נצפית זרימה, להדק את קווי החיבור כפי שהם עשויים להיות משוחרר.

2. מערכת ההתקנה וההליך Decellularization איברים

1. להרכיב את ביוריאקטור ולמקם אוריינטציה זקוף (איור 5). המערכת זלוף כוללת מחשב אישי (PC), בקר (PID) פרופורציונלי-אינטגרל-נגזרת, משאבה סחרור של אאו אינפוזיה, מגיב ביולוגי זלוף, מיכל לחץ ראש עבור LV perfusate שימור (2 ל' ליניקת בקבוק עם התחתון sidearm), ומשאבה סחרור כדי לנקז את הנוזלים העודפים מהגורם הראשי לחץ וכדי לאסוף זרימה יוצאת של אבא
2. מחצה גומי, לחבר את קו אינפוזיה, קו ראש-לחץ, הרשות הפלסטינית-יצוא קו וקו ביוריאקטור המנקזים יציאות משטח ה cap גומי הממוקמת מעל ביוריאקטור זלוף (איור 5A).
3. Decellularize לבבות תחת לחץ מתמיד של 120 מ מ כספית נמדד בספריית הבסיס של אבי העורקים. הלחץ הממוצע של בעירוי צריך להיות בתוך 14-18 מ מ כספית לאורך כל התהליך כולו decellularization.
4. Decellularize לבבות כדלקמן: 4 שעות של hypertonic פתרון (500 מ מ NaCl), 2 h של פתרון היפוטוניק (20 מ מ NaCl), h 120 של נתרן dodecyl סולפט (1% מרחביות) פתרון, ולאחר שטיפה סופית עם 120 L של X 1 PBS (איור 6A).
5. Decellularize הלבבות תחת לחץ קבוע שליטה (120 מ מ כספית). אינפוזיה קצב הזרימה לתוך אאו תלויי-הלב והוא, בממוצע, 98.06±16.22 mL/min לפתרון hypertonic, 76.14±7.90 mL/min לפתרון היפוטוניק, 151.50±5.76 mL/min עבור מרחביות, 185.24±7.10 mL/min עבור PBS. סה כ נפח נצרך כל ריאגנט הממוצע 23.36±5.70 L לפתרון hypertonic ו- 9.13±1.26 L לפתרון היפוטוניק.
6. Recirculate בחיצים 60 הסופי של 1% מרחביות (1 ליטר לגרם משקל הלב) עד לסוף זלוף מרחביות. איור 6A מראה ציר זמן עבור התהליך decellularization, העלאת נקודות קצה עבור איסוף נתונים: זרימה קצב ניטור (Ao ו הרשות הפלסטינית) ואוסף יצוא (PA ו- PA) מהראש לחץ במהלך decellularization.
7. מאז SVC של IVC מאתרים, סביר להניח כי כל נוזל שנאסף הרשות הפלסטינית היא התוצאה של זלוף כלילית בפועל (איור 5B). לקבוע יעילות זלוף כלילית חילוק קצב הזרימה של perfusate מתוך הרשות הפלסטינית על ידי קצב הזרימה של פתרון מוחדר ישירות לתוך אאו:
   זלוף כלילית יעילות = (%).
8. לבצע ניתוח השוואתי של perfusate שבידי הרשות הפלסטינית ואת בעירוי של פתרונות חדורים כפילויות טעינת μL 200 לאדם טוב בצלחת 96-ובכן התחתונה ברורה וקריאה ספיגת ב 280 ננומטר. הערך ספיגת, שנבחר מדעית לאחר שניסה ערכים שונים, נמצאה לתת את הטוב ביותר מנורמל ערכים.
9. השתמש את עכירות של ריאגנט חדורים נקי של הפקד. עכירות של perfusate יצוא מייצג שטיפה של שאריות תאים, ניתן לכמת באופן מיידי במהלך decellularization ככלי מעקב של התהליך.
10. במהלך בכביסה הסופי עם L 10 ל- 1 X PBS, להוסיף 500 מ"ל של מונטסקייה peracetic 2.1% חומצה פתרון סטרילי, שהמשרד עם NaOH 10N, מוביל לפתרון של 0.1% peracetic חומצה (v/v) ב- PBS. השתמש פתרון זה לחטא לגרדום.

3. הערכה של לבבות Decellularized

הערה: לאחר decellularization, נציג לבבות ישמש עבור מבחני הדמיה וביוכימי אנגיוגרפיה כלילית.

1. לבצע צילום אנגיוגרפיה כלילית הלב האנושי נציג decellularized לבחון את intactness של להערכת כלילית. בקצרה, התמונה באמצעות פלואורוסקופ, decellularized לב האדם לאחר ההזרקה של ניגודיות סוכן דרך בצינורית ostial כלילית ב הראשי ימינה ושמאלה העורקים הכליליים.
2. לנתח את הלב decellularized להשיג דגימות מאזורים 19 כדי להעריך את הנותרים חומצה deoxyribonucleic (DNA), גליקוזאמינוגליקן (איסור פרסום) ורמות מרחביות ברקמות decellularized. הסר את הבסיס של הלב על החדרים ומנתחים החדרים 4 חלקים שווים (איור 6C). לחלק כל מקטע anterior ואת אחורי החדר הימני (RV) בעירוי anterior ואת אחורי, מחצה interventricular (עירויים). הרקמה המכילה את איפקס גזור לתוך LV ואת RV לדיגום.
3. חותכים דגימות רקמה עבור מבחני ה-DNA, איסור פרסום ומרחביות (~ 15 מ ג של משקל רטוב).
4. לחלץ שני גדילי ה-DNA (dsDNA) על ידי דגימות של NaOH M 1 בשביל 3 h ב 65 ° C ו pH 7 באמצעות מאגר טריס-EDTA (TE) x 10 ו- 1 מ' חומצת מימן כלורי (HCl).
5. לכמת dsDNA באמצעות dsDNA של ערכת Assay עם עגל בלוטת התימוס רגיל (ראה טבלה של חומרים). לקרוא דוגמאות ב שכפל באמצעות קורא microplate קרינה פלואורסצנטית (עירור 480 ננומטר, פליטה-520 ננומטר). לחשב את אחוז dsDNA שיורית בליבם decellularized על-ידי השוואת dsDNA ריכוז כל רקמה את זה ב- cadaveric (% cadaveric).
6. להשיג sulfated GAGs לתוך פתרון על ידי דגימות רקמה בפתרון פפאין החילוץ (0.2 מ' מאגר סודיום פוספט עם EDTA ניתרן מלח, ציסטאין HCl, סודיום אצטט ו פפאין)-65 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות. למדוד איסור פרסום תוכן (כפולים) באמצעות ערכת Assay גליקוזאמינוגליקן.
7. Lyophilize דוגמאות עבור מרחביות assay ב מחוממת ואקום ולמדוד משקל יבש. להוסיף 200 µL של מים הנדסה גנטית כל מדגם מיובשים, homogenize כדי לחלץ את מרחביות שיורית לתוך פתרון. מערבבים שפתרון זה מרחביות כלורופורם ופתרון מתילן כחול (12 מ ג של מתילן כחול ב- 1 ליטר של 0.01 M HCl). זמנים תוססים יפריד לשכבת אורגני באמצעות קשירה לצבוע מתילן כחול.
8. שימוש בקורא microplate פלורסצנטיות, לקרוא את ספיגת (655 ננומטר) של תקנים, דוגמאות כפילויות כדי לחשב זמנים תוססים שיורית. לנרמל את הערך מרחביות כ משקל יבש של רקמות.
9. דגימות מאזורים עבה (קרי, LV, RV ו מחצה) של הלב האנושי עם מיקרוסקופ אופטי לא לינארית (NLOM) כדי לאשר את הסרת הסלולר לאחר decellularization. הגדרת NLOM מפורט שלנו הקודם פרסומים^18,19,20. NLOM מאפשר לנו תמונה תא, אלסטין, סיבי קולגן, צולבות הקישור חוטים שרירן דרך שלה שני הפוטונים קרינה פלואורסצנטית (TPF) וערוצים הרמונית דור (SHG) השני ללא שימוש כל אקסוגניים כתם או צבע²¹.

תוצאות

לאחר 7 ימים decellularization עם תמיסה לשיתוק זלוף אבי העורקים תחת לחץ מתמיד של 120 מ מ כספית, הלב האנושי הפך שקוף (איור 6B). הלב היה גזור בגסות למקטעים 19 לניתוח ביוכימי (דנ א, איסור פרסום ומרחביות) (איור 6C) כדי להעריך את המוצר decellularized הסופי.

Discussion

לידע שלנו, זהו המחקר הראשון decellularization ח הפוכה של לבבות אדם בתוך נרתיק מווסת עם ניטור בצילום מואץ של קצב זרימה והסרת הלכלוך תא. נרתיק דמוי קרום הלב שומרת את הכיוון של הלב יציב לאורך כל ההליך decellularization. השוקע, היפוך את ליבם שלם בתוך נרתיק מונע התייבשות וצמצום עומס יתר על העורקים (מתוך הלב משקל) ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-0 silk suture	Ethicon	SA85H	Suture used to ligate superior and inferior vena cava
1/4" x 3/8" connector with luer	NovoSci	332023-000	Connect aorta and pulmonary artery
Masterflex platinum-cured silicone tubing	Cole-Parmer	HV-96410-16	Tubing to connect heart chambers/veins
infusion and outflow line	Smiths Medical	MX452FL	For flowing solutions through the vasculature
Polyester pouch (Ampak 400 Series SealPAK Pouches)	Fisher scientific	01-812-17	Pericardium-like pouch for containing heart during decellularization
Snapware Square-Grip Canister	Snapware	1022	1-liter Container used for perfusing heart
Black rubber stoppers	VWR	59586-162	To seal the perfusion container
Peristaltic pump	Harvard Apparatus	881003	To pump fluid through the inflow lines and to drain fluids
2 L aspirator bottle with bottom sidearm	VWR	89001-532	For holding solutions/perfusate
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit	Life Technologies	P7589	For quantifying dsDNA
Calf thymus standard	Sigma	D4522	DNA standard
Blyscan Glycosaminoglycan Assay Kit	Biocolor Ltd	Blyscan #B1000	GAG assay kit
Plate reader	Tecan	Infinite M200 Pro	For analytical assays
GE fluoroscopy	General Electric	OEC 9900 Elite	Angiogram
Visipaque	GE	13233575	Contrast agent