거꾸로 방향 가압된 주머니 안에 전체 인간의 마음의 decellularization

요약

이 메서드는 decellularization의 삼투성 충격 및 최소한의 기관 매트릭스 중단 이온 세제의 관류에 따라 간단한 프로토콜을 사용 하 여 복잡 한 단단한 기관 수 있습니다. 그것은 흐름 역학 및 세포질 파편 유출의 실시간 모니터링으로 가압된 주머니 안에 인간의 마음에 대 한 소설 decellularization 기법으로를 구성 됩니다.

초록

말기 심장 마비 환자에 대 한 궁극적인 해결책은 장기 이식 이다. 하지만 기증자 마음은 제한 하 고 면역 억제가 필요 하 고, 궁극적으로 거부 발생할 수 있습니다. 기능 만들기, 헌 바이오 인공 심장 이러한 과제를 해결할 수 있습니다. Biofabrication 비 계 및 셀의 구성 하는 심장의 한 옵션입니다. 마이크로 및 매크로 아키텍처 뿐 아니라 조직 특정 구성 자연 비 계는 인간이 나 돼지 등 큰 동물에서 decellularizing 마음에 의해 얻어질 수 있다. Decellularization 3 차원 기질 및 맥 관 구조를 보존 하 고 나중 timepoint에 "cellularization"를 허용 하는 동안 세포 파편에 밖으로 세척 하는 작업이 포함 됩니다. 복잡 한 장기의 관류 decellularization 그를 찾는 우리의 소설에 대문자로 하는 것이 가능, 우리 비 transplantable 인간 심 혼에서 거꾸로 가압된 주머니 안에 배치 하 여 decellularize를 더 "생리" 방법 개발 방향, 제어 압력 하. 가압된 주머니를 사용 하 여의 목적은 대동맥 밸브 폐쇄 그것을 유지 하 고 향상 심근 관류를 통해 압력 그래디언트를 만드는 것입니다. 동시 평가 흐름 역학 및 decellularization 유체 유입 및 파편 유출 모니터링 하는 동안 세포 파편 제거, 간단한 심장 수리를 위해 사용 함으로써 생성 될 수 있는 비 계 (예: 패치로 또는 비 계 밸브) 또는 전체 기관 비 계.

서문

심장 마비 환자에서 높은 사망률에 지도 한다. 말기 심장 마비에 대 한 궁극적인 치료 옵션은 여 보세요-이식 합니다. 그러나, 공여 장기의 부족으로이 식 위한 긴 대기 목록 이며 환자 얼굴 후 이식 허들 만성 장기 거부^1,2에 평생 면역 억제에 이르기까지 다양. 바이오 기능 마음 decellularized 인간 크기는 환자 자신의 마음을 다시 채우기로 셀³이러한 장애물 우회 수.

중요 한 단계 "공학"는 마음은 적절 한 혈관과 parenchymal 구조, 구성 및 맞춤 가이드 함수 비의 생성 및 전달된 세포의 조직. 적절 한 프레임 워크의 발판에 시드 셀 환경을 인식 하 고 그 장기의 일환으로 예상된 기능을 수행 해야 합니다. 우리의 의견에 decellularized 기관 기질 (dECM) 이상적인 발판의 필요한 특성을 함유 한다.

기본 맥 관 구조를 이용 하 여 복잡 한 전체 기관 decellularization antegrade 또는 퇴행 성 관류⁴ 섬세 한 3D 기질 및 맥 관 구조^{2, 유지 하면서 세포 구성 요소 제거를 통해 달성 될 수 있다 5,,67}. Vivo에서, 영양소 분배 및 폐기물 제거⁸기능 맥 관 구조 공학 전체 기관 다만에서 중요 하다. 관상 동맥 관류 decellularization 쥐⁴, 또는 돼지^{4,7,,910,11 decellularized 마음 만들기에 효과적인 것으로 입증 되었습니다. ,,1213}및 인간^5,7,14,,1516. 그러나, 밸브, 심 방 및 다른 "얇은" 영역 무결성은 겪을 수 있다.

인간 크기 decellularized 심장 건설 기계는 압력 제어^7,9,10,,1112 또는 주입 흐름 속도 제어^13, 를 사용 하 여 돼지에서 얻어질 수 있다 ¹⁷ 및 압력을 사용 하 여 인간 기증자에서 제어^5,7,,1415. 수직 방향^5,,1516 또는 60 mmHg¹⁴ 에서 제어 하는 압력을 받고 16 일 이상 80-100 mmHg에서 제어 하는 압력을 받고 4-8 일 동안 발생 하는 인간 기증자 심 혼의 decellularization . Antegrade, 압력 제어 decellularization에서 대동맥 밸브 역량 관상 동맥 관류 효율성과 대동맥 루트에서 안정적인 압력 유지에 중요 한 역할을 하고있다. 우리의 이전 작품 심장의 방향을 따라서 끝⁹에서 비 계 무결성 decellularization 절차 동안 관상 동맥 관류 효율이 영향을 밝혔다.

우리의 이전 작품⁹의 계속으로 어떤 점에서 심장 모양의 주머니 전체 심장 decellularization 향상에 추가 됩니다 새로운 개념을 소개 합니다. 대동맥 루트에서 120 mmHg에서 제어 하는 압력을 받고 반대로 지향, 가압된 파우치 안에 배치 하는 인간 심 혼의 decellularization을 설명 합니다. 이 프로토콜 모니터링 흐름 프로필 및 decellularization 절차 관상 동맥 관류 효율성과 세포 파편 제거 평가를 통해 유출 미디어 컬렉션을 포함 합니다. 생 화 확 적인 분석 실험 방법의 효과 테스트 하려면 다음 수행 됩니다.

프로토콜

모든 실험에서 텍사스 심장 연구소 윤리 위원회 지침을 준수 됩니다.

1. 기관 준비

참고: 이식에 적합 하지 않은 LifeGift, 텍사스 (http://www.lifegift.org), 비영리 기관 조달 조직 기증 협력 인간의 마음에 승인 동의 연구를 위해 사용 되었다.

1. 마음을 조달, 정 맥으로 마음을 30000 U 덤플링을 달 이다. 안전 하 게 대동맥 정 맥 cardioplegia 봉합 하 고 채워 관류 라인을 연결 합니다. 열 등 한 베 나 정 맥 (IVC) 올바른 마음을 환기 구멍 왼쪽된 우량한 폐 정 맥 또는 심장의 왼쪽된 챔버 환기 왼쪽된 심 방 돌출부를 잘라.
2. Cardioplegia 또는 heparinized 염 분의 1 L 달 이다. 대동맥 아치 지점과 뛰어난 베 나 정 맥 (SVC), 기타 폐 정 맥 혈관 이나 주변 조직 첨부 파일에서 마음을 출시 해 부. 아이스 염에서 잘 heparinized 심장 잠수함
3. 기증 된 인간의 심장 검사 (anteriorly와 뒤로, 그림 1). 해 쟁반에 마음을 놓고 어떤 구조적 손상 또는 해 부 기형에 대 한 검사 합니다. 간 및 폐 이식에 대 한 조달 했다, 마음 짧은 열 등 한 베 나 정 맥 또는 좌 심 방 후 벽의 부재와 함께 발생할 수 있습니다.
4. 가능 결함-심 방 septal 결함 (ASD), 심 실 septal 결함 (VSD), 또는 밸브 (대동맥, 폐, mitral, tricuspid) 기형에 대 한 내부 검사를 수행 합니다.
5. 있으면 septal 결함, 적절 한 봉합 (그림 2A, 2B) 수정. Septal 결함의 교정은 decellularization 폐 동맥 (PA) 유출 탁도 측정을 통해 진행 상황을 모니터링 필요 합니다. Septal 결함의 교정 왼쪽 오른쪽 우회로를 제거, 따라서, PA에서 유출 관상 부 비 동을 통해 관상 동맥 순환에서 유출을 나타냅니다.
6. 2-0 비단 봉합 (그림 2C)와 뛰어난 및 하 부 베 나 정 맥 선
7. 후속 cannulation에 주요 PA (그림 2D)에서 대동맥 (Ao)를 해 부.
8. Ao와 PA로 선박, (그림 3)의 직경에 따라 커넥터를 삽입 하 고 2-0 비단 봉합 (그림 4A)와 그들을 보호.
9. 폐 정 맥 orifices 중 하나를 사용 하 여 배관 라인 왼쪽된 심 실 (LV) (그림 3) 쪽으로 왼쪽된 아 트리 움 (그림 4B)를 삽입 합니다.
10. 커넥터는 Ao와 PA (그림 3)에 있는 유출 라인에 배치 하는 주입 라인을 연결 합니다.
11. 거꾸로 방향 폴리에스터 주머니로 준비 된 마음 (거꾸로) 놓습니다.
12. 관류 컨테이너에 마음으로 주머니를 놓고 (그림 4C) 뚜껑을 닫습니다.
13. 각각의 라인을 고무 마 개 (컨테이너의 직경에 따라)에 해당 포트에 연결 하 고 폴 리 에스테 주머니 (그림 4C 와 그림 5B) 인감을 관류 컨테이너의 뚜껑에 삽입 합니다.
14. PA와 라인에서 유출 확인 고무 스 토퍼의 주입 포트를 통해 1 x 버퍼링 인산 염 (PBS) (136 m m NaCl, 2.7 m m KCl, 10mm 나₂HPO₄ , 증류수, pH 7.4에에서 1.8 m m KH₂포₄ ) perfuse 라스베가스에 삽입
15. 이 흐름을 사용 하 여 청소는 맥 관 구조에 혈액의 잔여 흔적의 기관. 그들은 느슨한 될 수 흐름 관찰 되지 않는 경우 연결 라인 조입니다.

2. 시스템 설치 프로그램 및 기관 Decellularization 절차

1. 생물을 조립 하 고 수직 방향 (그림 5)에 배치. 개인용 컴퓨터 (PC), 비례-적분-미분 (PID) 컨트롤러, Ao 주입에 대 한 연동 펌프, 관류 생물, LV perfusate 보존 (2 L 흡 인기 병 하단에 대 한 압력 머리 컨테이너 관류 시스템 포함 수급), 그리고 연동 펌프 압력 머리 컨테이너에서 과잉 액체를 배수 하 고 유출 펜에서 수집 하
2. 고무 심장에 관류 생물 (그림 5A) 위에 고무 캡 표면 포트 주입 선, 압력 머리 선, PA 유출 라인과 생물 배수 라인을 연결 합니다.
3. 대동맥 루트에서 측정 120 mmHg의 일정 한 압력 아래 마음 decellularize LV의 평균 압력은 전체 decellularization 과정을 통하여 14-18 mmHg 이내 이어야 한다.
4. 다음과 같이 마음을 decellularize: 마 솔루션 (500 m m NaCl), 소형 솔루션 (20 mM NaCl) 나트륨 라우릴 황산 (1 %SDS) 솔루션의 120 h의 2 h 4 h 및 1 X PBS (그림 6A)의 120 l 최종 세척.
5. 일정 한 압력 제어 (120 mmHg) 마음 decellularize Ao에 주입 유량 심장 종속적 이며, 평균 고 솔루션 98.06±16.22 mL/min, 소형 솔루션 76.14±7.90 mL/min, SDS를 위한 151.50±5.76 mL/min 및 PBS 위한 185.24±7.10 mL/min. 각 시 약의 총 소비 볼륨 평균 23.36±5.70 L 마 솔루션 및 소형 솔루션 9.13±1.26 L.
6. SDS 관류의 끝까지 1 %SDS (심장 무게의 그램 당 1 L)의 최종 60 L을 recirculate. 그림 6A 보여준다 decellularization 프로세스에 대 한 타임 라인 데이터 컬렉션에 대 한 끝점을 도출: 흐름 속도 모니터링 (Ao 및 PA) 및 유출 컬렉션 (PA 및 비-PA) 압력 머리에서 decellularization 동안.
7. 그것은 가정 하는 합리적 SVC, IVC는 출혈, 이후 실제 관상 동맥 관류 (그림 5B)의 결과 모든 액체는 PA에서 수집. Ao에 생긴된 솔루션의 흐름 속도 의해 perfusate PA에서의 흐름 속도 직접 나누어 관상 동맥 관류 효율성을 확인:
   관상 동맥 관류 효율 = (%).
8. PA와 LV와 중복에서 주입된 솔루션에서 분명 하단 96 잘 접시에 잘 당 200 μ 로드 고 280에서 흡 광도 읽고 얻은 perfusate의 비교 분석을 수행 nm. 흡 광도 값, 서로 다른 값을 시도한 후 경험적으로 선택 최고에 게 정규화 된 값을 발견 했다.
9. 깨끗 한 주입된 시의 탁도 사용 하 여 제어. 유출 perfusate의 탁도 세포 파편의 유실 나타내고 과정의 추적 도구로 decellularization 동안 즉시 측정할 수 있습니다.
10. 1 X PBS의 10 l 최종 세척 하는 동안 살 균 무력화 2.1% 초 산 솔루션, 10N NaOH, 0.1% 초 산 솔루션 (v/v) PBS에 선도와 무력화의 500 mL를 추가 합니다. 이 솔루션을 사용 하 여 발판 소독.

3입니다. Decellularized 하트의 평가

참고: decellularization, 후 대표 마음 관상 동맥 혈관 촬영 이미징 및 생 화 확 적인 분석 실험을 위해 사용할 수 것입니다.

1. 관상 동맥 맥 관 구조 intactness 검사 대표 decellularized 인간의 심장의 관상 동맥 혈관을 수행 합니다. 이미지는 짧게, 관상 동맥 ostial 정 주 오른쪽과 왼쪽 관상 동맥을 통해 대조 대리인의 주입 후 인간의 마음을 decellularized는 투시를 사용 하 여.
2. 나머지 deoxyribonucleic 산 (DNA), glycosaminoglycan (개 그) decellularized 조직에 SDS 수준 평가를 19 지역에서 샘플을 decellularized 심장 해 부. 심에서 심장의 베이스를 제거 하 고 심 4 동등한 섹션 (그림 6 c)으로 해 부. 앞쪽에 및 사후 우 심 실 (RV), 앞쪽에 및 사후 LV 및 interventricular 심장 (IVS)에 각 섹션을 나눕니다. 조직 꼭대기를 포함 하는 샘플링에 대 한 LV와 RV에 해 부.
3. 개 그, SDS, DNA 분석 실험 (~ 15 밀리 그램 젖은 무게의)에 대 한 조직 샘플을 잘라.
4. 65 ° C에서 3 h 1 M NaOH에 샘플을 소화 하 여 이중 가닥 DNA (dsDNA)를 추출 하 고 7 10 x 트리 스-EDTA (테) 버퍼와 1 M 염 산 (HCl)를 사용 하 여 pH를 조정.
5. 표준 송아지 thymus dsDNA 분석 결과 키트를 사용 하 여 dsDNA 계량 ( 재료의 표참조). 중복 형광 microplate 리더를 사용 하 여 샘플 읽기 (480 nm 및 520에 방출에서 여기 nm). 시체 (시체 %)에 각 조직에 dsDNA 농도 비교 하 여 decellularized 마음에 잔여 dsDNA의 비율을 계산 합니다.
6. 3 시간 동안 65 ° C에서 papain 추출 솔루션 (EDTA disodium 소금, 시스테인 HCl와 0.2 M 나트륨 인산 염 버퍼, 나트륨 아세테이트, papain)에서 조직 샘플을 소화 하 여 솔루션으로 sulfated 개 그를 가져올. (중복)에서 개 그 콘텐츠 Glycosaminoglycan 분석 결과 키트를 사용 하 여 측정 합니다.
7. 열띤된 진공 및 측정 건조 중량 분석 결과 SDS에 대 한 샘플 lyophilize 각 말린된 샘플을 초순의 200 µ L을 추가 하 고 솔루션으로 잔여 SDS 추출 균질. Chloroform을이 SDS 솔루션 및 메 틸 렌 블루 솔루션 (0.01 M HCl의 1 L에 메 틸 렌 블루의 12 mg) 믹스. SDS는 methylene 청색 염료에 바인딩하여 유기 층에는 별도 것입니다.
8. 흡수도 읽고 형광 microplate 리더를 사용 하 여 (655 nm) 표준 및 중복 잔여 SDS를 계산 하는 샘플의. 조직 건조 중량을이 SDS 값 정상화.
9. 두꺼운 지역 (즉, LV, RV 및 심장) decellularization 후 세포 제거 확인을 비선형 광학 현미경 (NLOM)와 인간의 마음에서에서 이미지 샘플. NLOM 설치는 우리의 이전 간행물^18,,1920에 상세한입니다. NLOM 어떤 외 인 얼룩 또는 염료²¹을 사용 하지 않고 이미지 셀, 엘라 스 틴, 콜라겐과 myosin 섬유의 2 광자 형광 (TPF)와 두 번째 고조파 생성 (SHG) 채널을 통해 우리를 수 있습니다.

결과

Antegrade 120 mmHg의 일정 한 압력 대동맥 관류와 7 일 decellularization, 후 인간의 마음 반투명 (그림 6B) 아닙니다. 마음은 조잡 한 생화학 (DNA, 개 그와 SDS) 분석 (그림 6 c) 최종 decellularized 제품 평가를 위한 19 섹션으로 해 부.

Decellularization 과정 전반에 걸쳐 다양 한 압력으로 다른 솔루션의 ...

토론

우리의 지식을 하려면이 보고서 거꾸로 decellularization 가압된 주머니 안에 인간 심 혼의 흐름 속도 세포 파편 제거의 시간 경과 모니터링에 첫 번째 연구 이다. 심장 모양의 주머니는 심장의 방향을 decellularization 절차에 걸쳐 안정 유지합니다. 잠수 하 고 주머니 안에 전체 마음 반전 탈수를 방지 하 고 때 (심장 무게)에서 대동맥에 과도 한 부담을 최소화는 종래의 직 립 Langendorff 관류 decellularization ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-0 silk suture	Ethicon	SA85H	Suture used to ligate superior and inferior vena cava
1/4" x 3/8" connector with luer	NovoSci	332023-000	Connect aorta and pulmonary artery
Masterflex platinum-cured silicone tubing	Cole-Parmer	HV-96410-16	Tubing to connect heart chambers/veins
infusion and outflow line	Smiths Medical	MX452FL	For flowing solutions through the vasculature
Polyester pouch (Ampak 400 Series SealPAK Pouches)	Fisher scientific	01-812-17	Pericardium-like pouch for containing heart during decellularization
Snapware Square-Grip Canister	Snapware	1022	1-liter Container used for perfusing heart
Black rubber stoppers	VWR	59586-162	To seal the perfusion container
Peristaltic pump	Harvard Apparatus	881003	To pump fluid through the inflow lines and to drain fluids
2 L aspirator bottle with bottom sidearm	VWR	89001-532	For holding solutions/perfusate
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit	Life Technologies	P7589	For quantifying dsDNA
Calf thymus standard	Sigma	D4522	DNA standard
Blyscan Glycosaminoglycan Assay Kit	Biocolor Ltd	Blyscan #B1000	GAG assay kit
Plate reader	Tecan	Infinite M200 Pro	For analytical assays
GE fluoroscopy	General Electric	OEC 9900 Elite	Angiogram
Visipaque	GE	13233575	Contrast agent