Decellularizzazione di cuore umano intero all'interno di una custodia pressurizzata in un orientamento invertito

Riepilogo

Questo metodo consente di decellularizzazione di un organo solido complesso utilizzando un semplice protocollo basato su shock osmotico e l'aspersione di detergente ionico con rottura di matrice minimal organo. Si compone di una tecnica di decellularizzazione romanzo per cuori umani all'interno di una custodia pressurizzata con monitoraggio in tempo reale del deflusso di detriti cellulari e dinamiche flusso.

Abstract

La soluzione definitiva per i pazienti con infarto di stadio finale è il trapianto d'organo. Ma cuori erogatori sono limitati, l'immunosoppressione è necessaria e in ultima analisi, può verificarsi il rifiuto. Creazione di un funzionale, cuore bio-artificiale autologo potrebbe risolvere queste sfide. Biofabrication di un cuore composto da impalcatura e cellule è un'opzione. Un'impalcatura naturale con composizione tessuto-specifici, come pure micro - e macro-architettura possa essere reperita da cuori decellularizing esseri umani o animali di grandi dimensioni come i maiali. Decellularizzazione prevede il lavaggio fuori detriti cellulari preservando la vascolarizzazione e 3D matrice extracellulare e permettendo di "cellularization" ad un determinato timepoint successivo. Capitalizzando sulla nostra individuazione che decellularizzazione di perfusione degli organi complessi del romanzo è possibile, abbiamo sviluppato un metodo più "fisiologico" per decellularize cuori umani non trapiantabili inserendoli all'interno di una custodia pressurizzata, in un invertito orientamento, sotto pressione controllata. Lo scopo di utilizzare una custodia pressurizzata è quello di creare gradienti di pressione attraverso la valvola aortica a tenerlo chiuso e migliorare la perfusione del miocardio. Valutazione simultanea della dinamica dei flussi e la rimozione di detriti cellulari durante decellularizzazione ci ha permesso di monitorare sia fluido afflusso e deflusso di detriti, generando così un'impalcatura che può essere utilizzato sia per la semplice riparazione cardiaca (ad es. come una patch o impalcatura di valvola) o come un'impalcatura di tutto-organo.

Introduzione

Insufficienza cardiaca conduce ad alto tasso di mortalità nei pazienti. L'opzione di trattamento finale per infarto di stadio finale è allo-trapianto. Tuttavia, c'è una lunga lista d'attesa per trapianto a causa della scarsità di donatori di organi e pazienti viso post-trapianto ostacoli che vanno da tutta la vita immunosoppressione cronica organo rifiuto¹,^,2. Il cuore funzionale Bioingegneria di ripopolare decellularizzati cuori di dimensioni umane con un propria del paziente cellule potrebbero aggirare questi ostacoli³.

Un importante passo in "ingegneria" un cuore è la creazione di un'impalcatura con adeguata struttura vascolare e parenchima, la composizione e la funzione di guidare l'allineamento e l'organizzazione delle cellule consegnate. In presenza del quadro appropriato, cellule seminate sul patibolo dovrebbero riconoscere l'ambiente e svolgere la funzione prevista come parte di quell'organo. A nostro parere, matrice extracellulare organo decellularizzati (dECM) comprende le caratteristiche necessarie dell'impalcatura ideale.

Utilizzando il sistema vascolare intrinseco, complesso intero-organo decellularizzazione può essere raggiunto via anterograda o aspersione retrograda⁴ per rimuovere componenti cellulari, preservando la matrice extracellulare 3D delicata e sistema vascolare^{2, 5,6,7}. Un funzionale sistema vascolare è importante in organi interi di Bioingegneria soli quanto è in vivo, per la distribuzione dei nutrienti e la rimozione dei rifiuti⁸. Decellularizzazione di perfusione coronarica ha dimostrato di essere efficace nella creazione di decellularizzazione cuori da ratti⁴, o maiali^{4,7,9,10,11 ,12,13}e gli esseri umani^5,7,14,15,16. Ancora, può soffrire l'integrità delle valvole, atri e altre regioni "sottile".

Umani-dimensione decellularizzati cuore ponteggi possono essere ottenuti da suini usando pressione controllo^7,9,10,11,12 o infusione flusso frequenza controllo^{13, 17} e da donatori umani usando pressione controllo^5,7,14,15. Decellularizzazione di cuori di donatori umani si verifica oltre il 4-8 giorni sotto pressione controllata a 80-100 mmHg in orientamento verticale^5,15,16 o oltre 16 giorni sotto pressione controllata a 60 mmHg¹⁴ . Sotto antegrade, pressione controllata decellularizzazione, la competenza della valvola aortica svolge un ruolo cruciale nel mantenimento della perfusione coronarica efficienza e pressione stabile alla radice aortica. Il nostro lavoro precedente ha rivelato che l'orientamento del cuore influenza l'efficienza di perfusione coronarica durante la procedura di decellularizzazione e pertanto l'integrità dell'impalcatura nel fine⁹.

Come una continuazione del nostro precedente lavoro⁹, introduciamo un nuovo concetto in cui un sacchetto di pericardio-come è aggiunto per migliorare tutto-cuore decellularizzati. Descriviamo il decellularizzazione di cuori umani disposti all'interno di sacchetti pressurizzati, inversamente orientati e sotto pressione controllata a 120 mmHg nella radice aortica. Questo protocollo include il monitoraggio del profilo di flusso e collezione di media di deflusso durante tutta la procedura di decellularizzazione per valutare l'efficienza di perfusione coronarica e rimozione detriti cellulari. Analisi biochimiche sono poi eseguite per testare l'efficacia del metodo.

Protocollo

Tutti gli esperimenti rispettato gli orientamenti del Comitato di etica dal Texas Heart Institute.

1. organo preparazione

Nota: In collaborazione con LifeGift, un'organizzazione di acquisti di organo senza scopo di lucro in Texas (http://www.lifegift.org), Donato cuori umani non adatto per il trapianto sono stati utilizzati per la ricerca con consenso approvato.

1. Per procurarsi i cuori, infondere per via endovenosa dell'eparina ai cuori 30.000-U. In modo sicuro suturare cardioplegia cannula nell'aorta e collegare una linea di aspersione bloccato. Forare la vena cava inferiore (IVC) per sfogare il cuore destro. Tagliare sia la vena polmonare superiore di sinistra o l'auricola sinistra per sfogare le camere sinistro del cuore.
2. Infondere 1 L di cardioplegia o soluzione fisiologica eparinizzata. Sezionare i rami dell'arco aortico, vena cava superiore (SVC) e altri vene polmonari per liberare il cuore da ogni attaccamento di tessuto vascolare o circostanti. Immergere il cuore ben eparinizzato in soluzione salina ghiacciata.
3. Ispezionare il cuore umano donato (sia anteriormente che posteriormente, Figura 1). Mettere il cuore su un vassoio per dissezione e controllare eventuali danni strutturali o le malformazioni anatomiche. Se il fegato o i polmoni sono stati acquistati per il trapianto, il cuore può presentare con una breve vena cava inferiore e/o assenza della parete atriale di sinistra posteriore.
4. Effettuare ispezione interna di eventuali difetti - difetto del setto atriale (ASD), difetto del setto ventricolare (VSD) o malformazione della valvola (aortica, polmonare, mitrale, tricuspide).
5. Se è presente un difetto settale, correggerlo con suture appropriate (Figura 2A, 2B). La correzione di difetti del setto è necessaria per monitorare il progresso di decellularizzazione via la misura di torbidità deflusso dell'arteria polmonare (PA). Correzione del difetto settale rimuove sinistra allo shunt di destro, quindi, il deflusso da PA rappresenta il deflusso dalla circolazione coronarica attraverso il seno coronario.
6. Lega i superiore ed inferiore della vena cava con sutura seta 2-0 (Figura 2).
7. Lontano il PA principale (Figura 2D) per il successivo inserimento di una canula la dissezione dell'aorta (Ao).
8. Inserire i connettori, in base al diametro del vaso, (Figura 3) in Ao e PA e bloccarli con punti di sutura in seta 2-0 (Figura 4A).
9. Inserire una linea di tubazione attraverso l'atrio sinistro (Figura 4B) e verso il ventricolo sinistro (LV) (Figura 3), utilizzando uno degli orifizi della vena polmonare.
10. Collegare una linea di infusione al connettore posizionato in Ao e la linea di uscita a quello di PA (Figura 3).
11. Inserire il cuore preparato un sacchetto poliestere in orientamento invertito (capovolto).
12. Posizionare la busta con il cuore in un contenitore di aspersione e chiudere il coperchio (Figura 4).
13. Collegare ciascuna delle linee per i rispettivi porti nel tappo di gomma (basato sul diametro del contenitore) e inserirla sul coperchio del contenitore di aspersione per sigillare il sacchetto poliestere (Figura 4 e figura 5B).
14. Irrorare 1 x tamponato fosfato salino (PBS) (136 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mm Na₂HPO₄ e 1,8 mM KH₂PO₄ in acqua distillata, pH 7.4) tramite la porta di infusione del tappo in gomma per verificare il deflusso dal PA e dalla linea di inserito in LV
15. Utilizzare questo flusso per pulire l'organo di qualsiasi residuo di sangue nel sistema vascolare. Se il flusso non è osservata, stringere le linee di connessione possano essere sciolti.

2. impostazione sistema e organo decellularizzazione procedura

1. Assemblare il bioreattore e posto in un orientamento verticale (Figura 5). Il sistema di perfusione comprende un personal computer (PC), regolatore di proporzionale-integrale-derivato (PID), una pompa peristaltica per infusione di Ao, un bioreattore di aspersione, un contenitore di testa pressione per ritenzione di perfusato LV (bottiglia da 2L aspiratore con fondo sidearm) e una pompa peristaltica per drenare liquidi in eccesso dal contenitore testa di pressione e di raccogliere il deflusso da PA.
2. Il setto di gomma, collegare la linea di infusione, testa di pressione linea, linea PA-deflusso e linea drenante bioreattore per i porti di superficie tappo gomma posizionati sulla parte superiore del bioreattore di aspersione (Figura 5A).
3. Decellularize cuori sotto costante pressione di 120 mmHg misurata alla radice aortica. Pressione media del ventricolo sinistro dovrebbe essere all'interno di 14-18 mmHg durante il processo di decellularizzazione intero.
4. Decellularize cuori come segue: 4 h di soluzione ipertonica (500 mM NaCl), 2 h di soluzione ipotonica (20 mM NaCl), 120 h di soluzione di sodio dodecil solfato (SDS 1%) e un lavaggio finale con 120 L di 1X PBS (Figura 6A).
5. Decellularize i cuori sotto controllo a pressione costante (120 mmHg). Tasso di flusso di infusione in Ao è cuore-dipendente ed è, in media, 98.06±16.22 mL/min per soluzione ipertonica, 76.14±7.90 mL/min per una soluzione ipotonica, 151.50±5.76 mL/min per SDS e 185.24±7.10 mL/min per la PBS. Il volume totale consumato di ciascun reagente medie 23.36±5.70 L per soluzione ipertonica e L 9.13±1.26 per una soluzione ipotonica.
6. Ricircolare il finale 60 L di 1% SDS (1L per grammo di peso del cuore) fino alla fine della perfusione di SDS. Figura 6A Mostra una sequenza temporale per il processo di decellularizzazione, suscitando gli endpoint per la raccolta dati: flusso di controllo di frequenza (Ao e PA) e raccolta di deflusso (PA e non-PA) dalla testa di pressione durante decellularizzati.
7. Poiché la SVC e IVC sono legati, è ragionevole supporre che tutto il liquido raccolto dal PA è il risultato di perfusione coronarica effettivo (figura 5B). Determinare l'efficienza di perfusione coronarica dividendo direttamente la portata del perfusato fuori il PA per il tasso di flusso della soluzione infusa in Ao:
   Efficienza di perfusione coronarica = (%).
8. Eseguire analisi comparativa del perfusato ottenuto da PA e LV o le soluzioni infuse in duplice copia con carico 200 μL per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti fondo chiaro e leggere l'assorbanza a 280 nm. Il valore di assorbanza, selezionato empiricamente dopo aver provato diversi valori, è stato trovato a dare il meglio di valori normalizzati.
9. Utilizzare la torbidità del reagente infuso pulito come il controllo. La torbidità del perfusato deflusso rappresenta la sbiaditura di detriti cellulari e possa essere quantificata istantaneamente durante decellularizzazione come uno strumento di monitoraggio del processo.
10. Durante il lavaggio finale con 10 L di 1X PBS, aggiungere 500 mL di sterile neutralizzati soluzione di acido peracetico 2,1%, neutralizzato con NaOH 10N, che conduce a una soluzione acido peracetico di 0.1% (v/v) in PBS. Utilizzare questa soluzione per sterilizzare il patibolo.

3. valutazione dei cuori decellularizzati

Nota: Dopo decellularizzazione, cuori rappresentante verranno utilizzati per analisi di imaging e biochimiche di angiogramma coronario.

1. Eseguire l'angiografia coronarica del cuore umano decellularizzato rappresentativo per esaminare l'integrità del sistema vascolare coronarico. Brevemente, usando un fluoroscopio, immagine decellularized cuore umano dopo l'iniezione di mezzo di contrasto attraverso la cannula ostial coronaria nelle principali arterie coronarie destra e sinistra.
2. Sezionare il cuore decellularizzato per ottenere campioni da 19 aree per valutare il residuo acido deossiribonucleico (DNA), glicosaminoglicani (GAG) e livelli di SDS in tessuti decellularizzati. Rimuovere la base del cuore da ventricoli e sezionare i ventricoli in 4 sezioni uguali (Figura 6). Dividere ogni sezione in anteriore e posteriore ventricolo di destra (RV), il LV anteriore e posteriore e il setto interventricolare (IVS). Il tessuto che contiene l'apice viene sezionato in LV e RV per il campionamento.
3. Tagliare i campioni di tessuto per analisi del DNA, GAG e SDS (~ 15 mg di peso umido).
4. Estrarre il DNA a doppia elica (dsDNA) digerendo campioni in 1 M NaOH per 3 h a 65 ° C e regolare il pH a 7 utilizzando buffer di Tris-EDTA (TE) 10 x e 1 M di acido cloridrico (HCl).
5. Quantificare il dsDNA utilizzando un dsDNA Assay kit con un timo di vitello standard (Vedi Tabella materiali). Leggere i campioni in duplicato utilizzando un lettore di micropiastre di fluorescenza (eccitazione a 480 nm ed emissione a 520 nm). Calcolare la percentuale di residuo dsDNA nei cuori decellularizzati confrontando concentrazione dsDNA in ogni tessuto a quello cadaverico (% cadaverico).
6. Ottenere solfonato gag in soluzione digerendo i campioni di tessuto in una soluzione di estrazione di papaina (tampone di fosfato di sodio 0,2 M con cisteina di EDTA disodico sale, HCl, acetato di sodio e papaina) a 65 ° C per 3 ore. Misurare il contenuto di GAG (in duplicato) utilizzando un Kit di analisi Glycosaminoglycan.
7. Lyophilize campioni per l'analisi di SDS in un peso a secco con vuoto e misura riscaldato. Aggiungere 200 µ l di acqua ultrapura per ogni campione essiccato e omogeneizzare per estrarre il residuo SDS in soluzione. Mescolare questa soluzione SDS al cloroformio e una soluzione di blu di metilene (12 mg di blu di metilene in 1 L di 0,01 M HCl). La SDS si separerà nello strato organico dal legame con il colorante blu di metilene.
8. Utilizzando un lettore di micropiastre di fluorescenza, leggere l'assorbanza (655 nm) degli standard e dei campioni in duplicato per calcolare il residuo SDS. Normalizzare questo valore di SDS al peso a secco dei tessuti.
9. Immagini di esempio da regioni spesse (cioè, LV, RV e setto) del cuore umano con la microscopia ottica non lineare (NLOM) per confermare la rimozione cellulare dopo decellularizzati. Il programma di installazione di NLOM è dettagliata nel nostro precedente Pubblicazioni^18,19,20. NLOM ci permette di cella di immagine, elastina, fibre di collagene e miosina attraverso i suoi due fotoni di fluorescenza (TPF) e canali di seconda generazione di armonica (SHG) senza utilizzare alcun esogeno di macchia o tintura²¹.

Risultati

Dopo un decellularizzazione di 7 giorni con aspersione aortico antegrade sotto costante pressione di 120 mmHg, il cuore umano trasformato traslucido (Figura 6B). Il cuore è stato grossolanamente dissecato in 19 sezioni per analisi biochimica (DNA, GAG e SDS) (Figura 6) per valutare il prodotto finale decellularizzato.

Durante tutto il processo di decellularizzazione, t...

Discussione

A nostra conoscenza, questo è il primo studio di decellularizzazione relazione invertita dei cuori umani all'interno di una custodia pressurizzata con monitoraggio time-lapse di rimozione di detriti di tasso e cella di flusso. Il sacchetto di pericardio-come mantiene l'orientamento del cuore stabile durante tutta la procedura di decellularizzazione. Sommergendo e invertendo i cuori interi all'interno di un sacchetto previene la disidratazione e riduce al minimo sforzo eccessivo sull'aorta (dal peso del cuore) quando con...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-0 silk suture	Ethicon	SA85H	Suture used to ligate superior and inferior vena cava
1/4" x 3/8" connector with luer	NovoSci	332023-000	Connect aorta and pulmonary artery
Masterflex platinum-cured silicone tubing	Cole-Parmer	HV-96410-16	Tubing to connect heart chambers/veins
infusion and outflow line	Smiths Medical	MX452FL	For flowing solutions through the vasculature
Polyester pouch (Ampak 400 Series SealPAK Pouches)	Fisher scientific	01-812-17	Pericardium-like pouch for containing heart during decellularization
Snapware Square-Grip Canister	Snapware	1022	1-liter Container used for perfusing heart
Black rubber stoppers	VWR	59586-162	To seal the perfusion container
Peristaltic pump	Harvard Apparatus	881003	To pump fluid through the inflow lines and to drain fluids
2 L aspirator bottle with bottom sidearm	VWR	89001-532	For holding solutions/perfusate
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit	Life Technologies	P7589	For quantifying dsDNA
Calf thymus standard	Sigma	D4522	DNA standard
Blyscan Glycosaminoglycan Assay Kit	Biocolor Ltd	Blyscan #B1000	GAG assay kit
Plate reader	Tecan	Infinite M200 Pro	For analytical assays
GE fluoroscopy	General Electric	OEC 9900 Elite	Angiogram
Visipaque	GE	13233575	Contrast agent