יכולת שחזור ודיוק משופרים של כימות תפוקה גבוהה של נתוני גידול חיידקים באמצעות קורא מיקרו-פלטות

Summary

כאן, מוצג פרוטוקול בעל תפוקה גבוהה למדידת נתוני צמיחה, כולל עקומות צמיחה, קצב צמיחה וקצב צמיחה מקסימלי. הפרוטוקול אומת ותוקף באמצעות שני חיידקים המייצרים ביופילם. ניתן להרחיב את התוצאות והגישה המיושמת במחקר זה לפרוטוקולים אחרים בעלי תפוקה גבוהה באמצעות קוראי מיקרו-פלטות.

Abstract

מחקר זה נועד לפתח פרוטוקול חוזר, אמין ובעל תפוקה גבוהה לניטור צמיחת חיידקים בצלחות של 96 בארות ולניתוח קצב הגידול המרבי. נקבעו עקומות הצמיחה ושיעורי הגידול המקסימליים של שני מיני חיידקים. נבדקו נושאים הכוללים (i) עיבוי מכסה, (ii) תיקון אורך מסלול, (iii) גודל החיסון, (iv) מרווח זמן הדגימה ו-(v) הטיה מרחבית. יכולת החזרה של הפרוטוקול הוערכה באמצעות שלושה שכפולים טכניים בלתי תלויים, עם סטיית תקן של 0.03 בין הריצות. שיעורי הגידול המקסימליים של Bacillus mycoides ו-Paenibacillus tundrae נקבעו כ±-0.99 ^h-1 ±-0.03 ^{h-1 ו-0.85 h-1} ±-0.025 ^h-1, בהתאמה. חיידקים אלה מאתגרים יותר לניטור אופטי בשל זיקתם להתקבץ יחד. מחקר זה מדגים את החשיבות הקריטית של גודל החיסון, תיקון אורך הנתיב, התחממות המכסה, מרווחי זמן הדגימה וההטיה המרחבית של לוח הבאר כדי להשיג נתונים אמינים, מדויקים וניתנים לשחזור על קוראי מיקרו-לוחות. ניתן להרחיב את הפרוטוקול שפותח ואת שלבי האימות שלו לשיטות אחרות באמצעות קוראי מיקרו-פלטות ופרוטוקולים בעלי תפוקה גבוהה, מה שמפחית את השגיאות המולדות של החוקרים ואת עלויות החומר.

Introduction

פיתוח עניין במניפולציה מולטי-אומיקס, כולל מחקרי מנגנון ומטבוליזם של חיידקים, מדגיש את החשיבות של שיטות אוטומטיות בתפוקה גבוהה כגון רישום נתוני גדילה ^1,2. נתוני גדילה הכוללים פרמטרים קינטיים, כגון שיעורי גדילה מקסימליים, יכולים לסייע באפיון תגובות חיידקים לתנאים פיזיקליים, כימיים ואנטיבקטריאליים שונים. נתוני קצב הגדילה הם משתנה תגובה סטנדרטי המשמש לחשיפת קשרים פוטנציאליים בין גנוטיפ^{לפנוטיפ 1} או להצביע על הבטיחות המיקרוביאלית וחיי המדף של תוצרת מזון ^3,4. טכניקות כגון אבולוציה מעבדתית אדפטיבית ^5,6,7, סינון גנומי רחב, בדיקות כימיות מסוימות⁸ ומסכים גנטיים שונים קדימה⁹ מסתמכות על קצב הגדילה כדי להעריך את התוצאות.

מדידות צפיפות אופטית (OD) של תרביות חיידקים הן שיטה מיקרוביולוגית סטנדרטית לניטור צמיחת חיידקים. מדידות OD נרשמות לרוב באורך גל של 600 ננומטר, תוך הסתמכות על פיזור אור וצפיפות התא^10,11. חוק באר-למברט מסביר את התלות של ערכי OD בריכוז (כלומר, צפיפות התא, מספר התא), אורך הנתיב ומקדם הספיגה. הגיאומטריה והמערכת האופטית של ספקטרופוטומטר משפיעות על קריאות OD¹¹. שיטות קלאסיות של מדידות OD יכולות להיות עתירות זמן ועבודה, והנתונים יכולים לשאת מגוון טעויות אנוש. בפרוטוקול זה, קורא מיקרו-פלטות משמש כדי להפחית את זמן האנליסט^12,13 ואת הסיכוי לזיהום ביולוגי. ניתוח תפוקה גבוהה באמצעות קוראי מיקרו-פלטות מיושם באופן נרחב בתחומי מיקרוביולוגיה שונים, כגון הקרנת חיידקים המייצרים ביופילם^14,15, עיכוב צמיחת חיידקים¹⁶, צמיחת תאי שמרים¹⁷, קביעת רגישות אנטי פטרייתית¹⁸ והקרנת רעילות של ננו-חומרים¹⁹.

כמה חוקרים פרסמו פרוטוקולים של קצב גידול חיידקים באמצעות קורא מיקרו-פלטות 12,20,21. עם זאת, פרוטוקול יסודי הבוחן את מהימנות הנתונים שנאספו לא הוכח במלואו. מדווח כי גורמים כמו סוג המין 22,23,24 וסרטי איטום משפיעים על יכולת החזרה עקב חוסר העברת חמצן בלוח בן 96 בארות^25,26. Delaney ואחרים דיווחו על אשכולות גדולים של Methylorubrum extorquens (זן מסוג בר) במדיום הגידול בעת שימוש בקורא מיקרו-פלטות, מה שגרם לנתוני צמיחה רועשים במיוחד²⁴. הבעיה נפתרה על ידי הסרת הגנים הקשורים לייצור ביופילם²⁴. בשל הפרשת חומרים פולימריים חוץ-תאיים, לחיידקים המייצרים ביופילם יש זיקה גדולה יותר להתלכד יחד וליצור אשכולות תאים. לכן, מאתגר יותר לעקוב אחר צמיחתם באמצעות טכניקות פיזור אור (למשל, ספקטרופוטומטרים וקוראי מיקרו-לוחות).

פרוטוקול זה נועד לקבוע צעדים להשגת נתונים הניתנים לשחזור בשיטה בעלת תפוקה גבוהה באמצעות קורא מיקרו-פלטות. נעשה שימוש ב-Bacillus mycoides ו-Paenibacillus tundrae בשל הצמיחה המהירה שלהם ויכולת ייצור הביופילם, שבאופן מסורתי מאתגרים בגישות ידניות ואוטומטיות. גורמים כגון (i) תיקון אורך מסלול, (ii) עיבוי על המכסה, (iii) גודל החיסון, (iv) מרווח זמן הדגימה ו-(v) הטיה מרחבית נחקרו כדי להעריך את המהימנות והשחזור של הנתונים. פרוטוקול זה מציג שלבים לניטור מדויק של צמיחת חיידקים ומדידת שיעורי גידול ספציפיים באמצעות קורא מיקרו-פלטות.

Protocol

הערה: יש לבצע את כל השלבים בפרוטוקול זה בתנאים סטריליים (כלומר, בין שתי להבות או ארון בטיחות ביולוגית). כל החומרים והכלים עוברים חיטוי למשך 20 דקות. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים אודות כל החומרים, הציוד והתוכנה המשמשים בפרוטוקול זה. ידיים עטויות כפפות מחוטאות, נשמרות רטובות בחומר חיטוי ידיים או בתמיסת אלכוהול 70% למשך דקה אחת לפחות, ולא מוסרות מארון הבטיחות לאחר מכן. אחרת, יש לחזור על הליך החיטוי לפני הכנסת הידיים בחזרה לארון הבטיחות. זהירות: ודא שחומר החיטוי מתאדה לחלוטין לפני השימוש בלהבה פתוחה.

הערה: שני חיידקים בודדו מסינון ביולוגי של מי שתייה כפי שהוסבר קודם לכן²⁷ בשל יכולתם לייצר ביופילם. הם זוהו על ידי ריצוף rRNA מלא של 16S והוגשו ל-NCBI כ-Bacillus mycoides (SAMN10518261) ו-Paenibacillus tundrae (SAMN10452279).

1. הכנת מלאי חיידקים בגליצרול

1. שקלו 3 גרם אבקת מרק סויה טריפטי (TSB) והמיסו אותה ב-100 מ"ל מים מזוקקים. חיטוי המרק למשך 20 דקות ונותנים לו להתקרר לטמפרטורת החדר. הוסף 50 מ"ל TSB לבקבוק של 50 מ"ל.
2. מעבירים את החיידקים לצלחות אגר^27,28. בעזרת לולאה, בחר מושבת חיידקים מצלחת האגר. הוסף את תוכן הלולאה לבקבוק על ידי סיבוב עדין של הלולאה. דגרו את הבקבוק למשך הלילה ב-30 מעלות צלזיוס ±-1 מעלות צלזיוס עם טלטול מסלול ב-150 סל"ד.
   הערה: יש לכוונן את הטמפרטורה והרעידות בהתאם לסוג המתח.
3. הכינו עוד בקבוק של 50 מ"ל עם 47.5 מ"ל TSB. העבירו 2.5 מ"ל מתרבות הלילה לבקבוק. דגרו אותו במשך 5-6 שעות כדי להגיע ל-OD₆₀₀ = 0.6 0.05 (כדי להגיע לשלב האקספוננציאלי האמצעי).
4. העבירו את התרבית לצינור צנטריפוגה מעוקר של 50 מ"ל. צנטריפוגה את התרבות ב -2,200 × גרם למשך 10 דקות. רוקנים את המרק בעדינות כדי למנוע אובדן תאים שנאספו בתחתית הצינור.
5. הוסף 5 מ"ל של מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS) לאותו צינור וצנטריפוגה ב-2,200 × גרם למשך 10 דקות. חזור על שלב זה 3 פעמים.
6. התאם את ה-OD₆₀₀ של התאים ל-0.6 0.05 על ידי שימוש בפיפטה כדי לטטר כמות מספקת של תמיסת PBS. רשום במדויק את הכמות הנוספת של PBS לשימוש עתידי.
7. טיטראט גליצרול לתרחיף כדי להגיע ל-20% v/v. מכסה את הצינור והמערבולת למשך 15 שניות.
8. העבירו 1.5 מ"ל מהמתלה ל-2 מ"ל קריוביאלים. הכניסו את הקריוביאל לקופסה מתאימה ואחסנו אותם במקפיא בחום של -80 מעלות צלזיוס.

2. הכינו תרבית לילה.

1. הניחו לקריביאלים עם ציר חיידקים להפשיר בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות או עד שהתוכן נוזלי.
   הערה: מומלץ לא להאיץ את תהליך ההפשרה.
2. הכן צינור מעוקר עם 10 מ"ל TSB. העבירו 50 מיקרוליטר ממתלה המלאי לצינור. דגרו את הצינור למשך הלילה (16-18 שעות) ב-30 מעלות צלזיוס ±-1 מעלות צלזיוס עם טלטול מסלול ב-150 סל"ד.

3. מכינים את החיסון.

1. הכן צינור עם 10 מ"ל TSB מעוקר. העבירו 500 מיקרוליטר מתרבית הלילה לצינור. דגרו אותו במשך 6-8 שעות כדי להגיע ל-OD₆₀₀ = 0.6 0.05 (או להגיע לשלב האקספוננציאלי האמצעי).
2. העבירו את התרבית לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל. צנטריפוגה את הצינור ב -2,200 × גרם למשך 10 דקות. שופכים את המרק בעדינות.
3. הוסף 5 מ"ל PBS וצנטריפוגה ב -2,200 × גרם למשך 10 דקות. חזור על שלב זה 3 פעמים.
4. כוונן את ה-OD₆₀₀ של התאים ל-0.6 0.05 על ידי טיטרציה של תמיסת PBS באמצעות פיפטה. רשום במדויק את הכמות הנוספת של PBS לשימוש עתידי.

4. העברת מדיום גידול לקורא המיקרופלייט

1. בחר צלחת באר שקופה, סטרילית, עם תחתית שטוחה עם מכסה (כלומר, צלחת 96 בארות, צלחת 6 בארות, צלחת 12 בארות).
2. מדוד את תיקון אורך הנתיב עבור המיקרו-לוח באמצעות מי DI לפני הפעלת הפרוטוקול, כפי שהוסבר בשלב 1.10.
3. צייר טבלת התייחסות המבוססת על לוחית הבאר שנבחרה כדי לציין את מיקומי הדגימות לפני הטעינה. לדוגמא, צייר שולחן בגודל 8X12 לצלחת של 96 בארות.
   הערה: טבלת ההפניות מונעת בלבול במהלך שלבי הדגירה ואיסוף התוצאות.
4. הניחו את הפריטים הבאים בארון בטיחות ביולוגית: מיקרופלייט עם מכסה, פיפטור 1,000 מיקרוליטר ו-200 מיקרוליטר, קצות פיפטה של 1,000 מיקרוליטר ו-200 מיקרוליטר, מספר קריוביאלים, של 25 מ"ל, מדיום הגידול והחיסון.
   הערה: יש להעביר את הפריטים שהוזכרו לארון הבטיחות הביולוגית באופן אספטי.
5. הוסף 10 מ"ל מצע גידול לכוס. העבירו את כמות החיסון המחושבת לכוס עם מצע הגידול.
   הערה: יחסי החיסון בפרוטוקול זה הם 1% ו-5%. לדוגמה, כדי להשיג יחס חיסון של 5% ו-1%, הוסף 500 מיקרוליטר ו-100 מיקרוליטר של החיסון ל-9.5 מ"ל ו-9.9 מ"ל של מצע הגידול, בהתאמה.
6. לאחר הוספת החיסון, יש לנער בעדינות את הכוס לקבלת פיזור אחיד. הוצא 200 מיקרוליטר מהמדיום המחוסן לבארות המיועדות באמצעות טבלת הייחוס. בחר לפחות שלוש בארות שישמשו כבקרות על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של מצע הגידול (ללא חיסון).
   הערה: ודא שבארות הבקרה מסומנות בבירור בטבלת הייחוס. אם נצפתה גידול (זיהום) כלשהו בבארות אלה, יש לחזור על הניסוי.
7. הוצא 200 מיקרוליטר של מי DI לבארות הקצה שבהן קצב האידוי גבוה יותר. הנח את המכסה בעדינות לפני הוצאת צלחת 96 הבארות מארון הבטיחות. הנח את צלחת 96 הבארות בקורא הצלחות בזהירות, והבטיח שלא יהיו תנועות פתאומיות.

5. הגדרות קורא Microplate

1. הפעל את קורא המיקרו-לוחות ולאחר מכן השתמש בתוכנה המוטמעת כדי ליצור את הפרוטוקול המותאם אישית. במנהל המשימות, פתח את הפרוטוקול ובחר צור חדש | פרוטוקול סטנדרטי. פתח את נוהל והתאם את ההגדרות באופן הבא:
   1. הגדר את הטמפרטורה ל-30 מעלות צלזיוס (או את ערכי היעד) באמצעות הגדרת טמפרטורה.
   2. לחץ על Incubator On ולאחר מכן הגדר את השיפוע ל-1 מעלות צלזיוס.
      הערה: כדי למנוע נתונים לא אמינים עקב עיבוי על המכסה, ודא שהשיפוע מוגדר ל-1 מעלות צלזיוס.
   3. בחר באפשרות חימום מוקדם , תוך הבטחת פיזור חום אחיד לאורך צלחת הבאר.
   4. פתח את התחל קינטי ובחר את משך הדגירה הרצוי באמצעות זמן הריצה (למשל, 12:00:00 או 24:00:00 וכו') ומרווח בין קריאות עבור 00:30:00 (מייצג 30 דקות) או 01:00:00 (מייצג שעה).
      הערה: קריאת כל צלחת של 96 בארות אורכת כדקה אחת.
   5. הגדר את הגדרות הרעידות באופן הבא: פתח את טלטול; הגדר את מצב טלטול לליניארי; לחץ על טלטול מתמשך; והתאם את התדר ל-567 עותקים לדקה (או כל ערך רצוי).
   6. הגדר את הגדרות הקריאה של OD באופן הבא: לחץ על קרא | ספיגה; בחר נקודת קצה/קינטית ומונוכרומטורים; הגדר את אורך הגל ל-600 ננומטר; ולחץ על אימות | שמור כדי לשמור אותו כפרוטוקול חדש עם השם והתאריך המתאימים.

6. רישום נתוני צמיחה

1. פתח את מנהל המשימות | קרא עכשיו.
2. בחר את הפרוטוקול השמור ולאחר מכן לחץ על אישור כדי להתחיל את הפרוטוקול.
3. שמור את הקריאות לניתוח נתונים.

7. ניתוח נתונים

1. העבר את תוצאות OD₆₀₀ (נתוני צמיחה) לפורמט גיליון אלקטרוני. בקטע התוצאות , לחץ על אפשרות התמונה עבור כל באר כדי לצפות בעקומות הצמיחה הסופיות.
2. פתח את קובץ הגיליון האלקטרוני וסדר מחדש את הנתונים המוקלטים על סמך טבלת ההפניה. הפחת את הערך הממוצע של הקריאות הריקות מהקריאות האחרות.
   הערה: ריקים הם קריאות ה-OD בזמן אפס. בפרוטוקול זה, ערכי OD₆₀₀ נלקחים בחשבון לצורך חישוב. ניתן להשתמש בצפיפות התאים אם עקומת הכיול עבור OD₆₀₀ לעומת ספירת תאים זמינה.

8. קביעת קצב צמיחה

1. השתמש בנתונים המועברים בגיליון האלקטרוני שנוצר בשלב 1.6. השתמש בשיטה המתוארת להלן ובמשוואה (1) כדי להעריך את קצב הגידול.
   (1)
   כאשר μ הוא קצב הצמיחה, OD_i הוא ה-OD₆₀₀ בכל נקודת זמן, OD_i-1 הוא הערך הראשוני של OD₆₀₀ בנקודת הזמן האחרונה, t_{i ו-t i-1} הם הפרשי הזמן בין שתי הנקודות שהוזכרו (למשל, 0.5 למרווחי זמן של 30 דקות, 1 למרווחי זמן של שעה).
2. חשב את הממוצע וסטיית התקן של חמישה שיעורי גידול עוקבים באמצעות תוכנת ניתוח הנתונים הרצויה. שימו לב שהממוצע הגדול ביותר עם סטיית התקן הנמוכה ביותר הוא קצב הגידול המקסימלי (μ_מ') ¹².

9. קביעת הטיה מרחבית

הערה: קוראים ולוחות מיקרו-פלטות מציגים הטיה בתוצאות. חיוני להעריך את ההטיות המרחביות של הלוחות המשמשים בקורא מיקרו-פלטות ספציפי כדי להבטיח את האמינות והשחזור של התוצאות. כדי להשיג זאת, השתמש בשלבים הבאים:

1. חזור על שלבים 1.2-1.6.
2. רשום את הנתונים ונתח לפי שלב 1.7 ושלב 1.8 כדי לחשב את קצב הגידול עבור כל באר.
3. צור מפת חום כדי לדמיין את שינויי קצב הצמיחה בצלחת 96 הבארות.
4. בצע את הניתוח הסטטיסטי (ראה טבלאות משלימות), תוך הקפדה על הבדלים משמעותיים בין הבארות.
   הערה: חיוני להשתמש באותו סוג חיידקים ובאותו גודל חיסון בכל הבארות.

10. אימות קריאת OD וגורם תיקון אורך נתיב

הערה: קביעת גורם תיקון אורך הנתיב היא חיונית לאימות הנתונים ולהבטיח אמינות ותוקף במכשירים שונים.

1. יש להשתמש בשלב 1.2 ושלב 1.3 להכנת חיסון הלילה של B. mycoides.
2. מכינים שלוש צלוחיות מעוקרות של 50 מ"ל ומוסיפים 49.5 מ"ל TSB טרי לכל בקבוק. הוסף 500 מיקרוליטר של החיסון לכל בקבוק בארון בטיחות באופן אספטי. הוסף 50 מ"ל TSB לא מחוסן לבקבוק מעוקר, שישמש כבקרה.
3. דגרו את הצלוחיות ב-30 מעלות צלזיוס ו-150 סל"ד. כל 30 דקות, קח דגימות מכל בקבוק באופן אספטי וקרא ורשום OD₆₀₀ בספקטרופוטומטר.
4. הוסף 9.9 מ"ל TSB לכוס של 25 מ"ל. מוסיפים 100 מיקרוליטר חיסון לכוס ומנערים בעדינות.
5. מוסיפים 200 מיקרוליטר מהתערובת בכוס לשש הבארות בעמודה נבחרת בצלחת של 96 בארות. הוסף 200 מיקרוליטר של TSB לא מחוסן לשלוש בארות כבקרה. מלאו את בארות הקצה ב-200 מיקרוליטר מי DI.
6. הנח את המכסה והעביר בעדינות את צלחת 96 הבארות לקורא המיקרופלייט. בצע את שלב 1.5 ושלב 1.6 כדי לתעד את נתוני הצמיחה.
7. התווה את ה-OD₆₀₀ מקורא המיקרו-פלטות כנגד ה-OD₆₀₀ מהספקטרופוטומטר. שימו לב שהשיפוע הוא ההיסט בין שתי קבוצות הקריאות, הנקרא גורם תיקון אורך המסלול.
   הערה: הדגירה של החממה וקורא המיקרו-פלטות צריכה להיעשות בו זמנית באותו היום.

תוצאות

אימות קריאת OD וגורם תיקון אורך נתיב
דגימות מפוצלות של תרבית B. mycoides נלקחו בנקודות זמן שונות ונמדדו באמצעות קורא המיקרו-פלטות והספקטרופוטומטר (איור 1A). צעד זה ננקט כדי לאמת את התוצאות במכשירים שונים. נתוני OD₆₀₀ היו בקורלציה אך לא תואמים ...

Discussion

קוראי מיקרו-פלטות מאפשרים להשיג שיעורי צמיחה עקביים וניתנים לחזרה. טכנולוגיה זו ממזערת טעויות אנוש ומאפשרת דגימה בתפוקה גבוהה. כמות התרבית הקטנה הנדרשת לדגימה הופכת גישה זו לחלופה אטרקטיבית ובעלות נמוכה לספירת תאים באמצעות צלוחיות או מבחנות. קוראי Microplate מאפשרים גודל מ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Centrifuge tubes - 15 mL	ThermoFisher- Scientific	339650	Sterile
Centriguge tubes - 50 mL	ThermoFisher- Scientific	339652	Sterile
Disposable inoculating loop , 10 µL	Cole-Parmer	UZ-06231-08	Sterile
Erlenmeyer flasks - 250 mL	Cole-Parmer	UZ-34502-59	Glass
Isopropanol	ThermoFisher- Scientific	396982500	≥99.0
Phosphate Buffer Saline	Sigma-Aldrich	P4417
Pipett tips 1,000 µL	ThermoFisher- Scientific	UZ-25001-76
Pipett tips 10 mL	ThermoFisher- Scientific	UZ-25001-83
Pipett tips 200 µL	ThermoFisher- Scientific	UZ-25001-85
Pipett tips 5 mL	ThermoFisher- Scientific	UZ-25001-80
Pipettor 1,000 µL	Cole-Parmer	UZ-07909-11
Pipettor 10 mL	Cole-Parmer	UZ-07909-15
Pipettor 200 µL	Cole-Parmer	UZ-07909-09
Pipettor 5 mL	Cole-Parmer	UZ-07859-30
Tryptic Soy Broth	Millipore	22091	Suitable for microbiology