Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Method Article
Здесь представлен протокол с высокой пропускной способностью для измерения данных о росте, включая кривые роста, темпы роста и максимальные темпы роста. Протокол был проверен и валидирован с использованием двух бактерий, продуцирующих биопленку. Результаты и подход, примененные в этом исследовании, могут быть распространены на другие протоколы с высокой пропускной способностью с использованием считывателей микропланшетов.
Это исследование было направлено на разработку воспроизводимого, надежного, высокопроизводительного протокола для мониторинга роста бактерий в 96-луночных планшетах и анализа максимальной скорости роста. Определены кривые роста и максимальные темпы роста двух видов бактерий. Были исследованы такие проблемы, как (i) конденсация крышки, (ii) коррекция длины пути, (iii) размер инокуляции, (iv) временной интервал отбора проб и (v) пространственное смещение. Повторяемость протокола оценивалась с помощью трех независимых технических повторений со стандартным отклонением 0,03 между прогонами. Максимальные темпы роста Bacillus mycoides и Paenibacillus tundrae составили (среднее значение ± SD) 0,99 ч−1 ± 0,03 ч−1 и 0,85 ч−1 ± 0,025 ч−1 соответственно. Эти бактерии сложнее контролировать оптически из-за их склонности к слипанию. Это исследование демонстрирует критическую важность размера инокуляции, коррекции длины пути, нагрева крышки, временных интервалов отбора проб и пространственного смещения скважинной пластины для получения надежных, точных и воспроизводимых данных на микропланшетах. Разработанный протокол и этапы его верификации могут быть расширены на другие методы с использованием микропланшетных ридеров и протоколов с высокой пропускной способностью, что снижает врожденные ошибки исследователей и материальные затраты.
Растущий интерес к мультиомиксным манипуляциям, включая исследования механизмов и метаболизма бактерий, подчеркивает важность высокопроизводительных и автоматизированных методов, таких как запись данных о росте 1,2. Данные о росте, включающие кинетические параметры, такие как максимальные темпы роста, могут помочь охарактеризовать реакцию бактерий на различные физические, химические и антибактериальные условия. Данные о темпах роста являются стандартной переменной отклика, используемой для выявления потенциальных связей генотип и фенотипы1 или указания на микробную безопасность и срок годности пищевых продуктов 3,4. Такие методы, как адаптивная лабораторная эволюция 5,6,7, полногеномный скрининг, определенные химические анализы8 и различные прямые генетические скрининги9, полагаются на темпы роста для оценки результатов.
Измерение оптической плотности (OD) бактериальных культур является стандартным микробиологическим методом мониторинга роста бактерий. Измерения наружного диаметра часто записываются на длине волны 600 нм, полагаясь на рассеяние света и плотность ячеек10,11. Закон Бира-Ламберта объясняет зависимость значений OD от концентрации (т. е. плотности ячеек, количества ячеек), длины пути и коэффициента поглощения. Геометрия и оптическая система спектрофотометра влияют на показания наружного диаметра11. Классические методы измерения наружного диаметра могут быть очень трудоемкими и трудоемкими, а данные могут содержать множество человеческих ошибок. В этом протоколе считыватель микропланшетов используется для уменьшения времени анализа12,13 и вероятности биологического загрязнения. Высокопроизводительный анализ с использованием считывателей микропланшетов широко применяется в различных областях микробиологии, таких как скрининг бактерий, продуцирующих биопленку14,15, ингибирование роста бактерий16, рост дрожжевых клеток17, определение чувствительности к противогрибковым препаратам18 и скрининг токсичности наноматериалов19.
Несколько исследователей опубликовали протоколы скорости роста бактерий с использованием считывателя микропланшетов 12,20,21. Тем не менее, тщательный протокол, который проверяет достоверность собранных данных, не был полностью установлен. Сообщается, что такие факторы, как тип видов 22,23,24 и уплотнительные ленты, влияют на повторяемость из-за недостаточности переноса кислорода в 96-луночной пластине 25,26. Delaney et al. сообщили о больших скоплениях Methylorubrum extorquens (штамм дикого типа) в питательной среде при использовании считывателя микропланшетов, что вызывало чрезвычайно зашумленные данные о росте24. Проблема была решена путем удаления генов, связанных с производством биопленки24. Благодаря секреции внеклеточных полимерных веществ, бактерии, продуцирующие биопленку, имеют большее сродство к слиянию и созданию клеточных кластеров. Поэтому отслеживать их рост с помощью методов светорассеяния (например, спектрофотометров и считывателей микропланшетов) сложнее.
Этот протокол направлен на установление шагов для получения воспроизводимых данных методом с высокой пропускной способностью с использованием считывателя микропланшетов. Bacillus mycoides и Paenibacillus tundrae были использованы из-за их быстрого роста и способности производить биопленку, что традиционно сложно при ручном и автоматизированном подходе. Для оценки надежности и воспроизводимости данных были исследованы такие факторы, как (i) коррекция длины пути, (ii) конденсация на крышке, (iii) размер инокулюма, (iv) временной интервал отбора проб и (v) пространственное смещение. В этом протоколе представлены шаги для точного мониторинга роста бактерий и измерения конкретных темпов роста с помощью считывателя микропланшетов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги в этом протоколе должны выполняться в стерильных условиях (т.е. между двумя огнями или в шкафу биобезопасности). Все материалы и инструменты подвергаются автоклавированию в течение 20 минут. Подробные сведения обо всех материалах, оборудовании и программном обеспечении, используемых в этом протоколе, см. в Таблице материалов . Руки в перчатках дезинфицируют, хранят влажными дезинфицирующим средством для рук или 70% спиртовым раствором не менее 1 минуты, после чего не вынимают из защитного шкафа. В противном случае процедуру дезинфекции необходимо повторить перед тем, как вернуть руки обратно в защитный шкаф. ВНИМАНИЕ: Перед использованием открытого огня убедитесь, что дезинфицирующее средство полностью испарилось.
Примечание: Две бактерии были выделены из биофильтрации питьевой воды, как объяснялось ранее27, из-за их способности производить биопленку. Они были идентифицированы с помощью полного секвенирования рРНК 16S и представлены в NCBI как Bacillus mycoides (SAMN10518261) и Paenibacillus tundrae (SAMN10452279).
1. Приготовление бактериального материала в глицерине
2. Подготовьте культуру на ночь.
3. Подготовьте инокулятив.
4. Перенос питательной среды на считыватель микропланшетов
5. Настройки считывателя микропланшетов
6. Запись данных о росте
7. Анализ данных
8. Определение темпов роста
9. Определение пространственного смещения
ПРИМЕЧАНИЕ: Считыватели микропланшетов и планшеты вносят смещение в результаты. Крайне важно оценить пространственные смещения пластин, используемых в конкретном считывателе микропланшетов, чтобы обеспечить надежность и воспроизводимость результатов. Для этого выполните следующие действия:
10. Валидация показаний OD и поправочный коэффициент длины пути
ПРИМЕЧАНИЕ: Определение поправочного коэффициента длины пути имеет решающее значение для проверки данных и обеспечения надежности и валидности на различных устройствах.
Валидация показаний OD и поправочный коэффициент длины пути
Разделенные образцы культуры B. mycoides были взяты в разные моменты времени и измерены с помощью считывателя микропланшетов и спектрофотометра (рис. 1A). Этот шаг был предпринят для...
Считыватели микропланшетов позволяют получать стабильные и повторяемые темпы роста. Эта технология сводит к минимуму человеческие ошибки и обеспечивает высокопроизводительный отбор проб. Небольшое количество культуры, необходимое для каждого образца, делает этот ...
У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.
Эта работа была профинансирована Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям (NSERC) / Кафедрой промышленных исследований в области водных ресурсов Галифакса в области качества и очистки воды (грант No. IRCPJ 349838-16). Коллектив авторов также выражает признательность Аните Тейлор за помощь в рецензировании этой статьи.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
Centrifuge tubes - 15 mL | ThermoFisher- Scientific | 339650 | Sterile |
Centriguge tubes - 50 mL | ThermoFisher- Scientific | 339652 | Sterile |
Disposable inoculating loop , 10 µL | Cole-Parmer | UZ-06231-08 | Sterile |
Erlenmeyer flasks - 250 mL | Cole-Parmer | UZ-34502-59 | Glass |
Isopropanol | ThermoFisher- Scientific | 396982500 | ≥99.0 |
Phosphate Buffer Saline | Sigma-Aldrich | P4417 | |
Pipett tips 1,000 µL | ThermoFisher- Scientific | UZ-25001-76 | |
Pipett tips 10 mL | ThermoFisher- Scientific | UZ-25001-83 | |
Pipett tips 200 µL | ThermoFisher- Scientific | UZ-25001-85 | |
Pipett tips 5 mL | ThermoFisher- Scientific | UZ-25001-80 | |
Pipettor 1,000 µL | Cole-Parmer | UZ-07909-11 | |
Pipettor 10 mL | Cole-Parmer | UZ-07909-15 | |
Pipettor 200 µL | Cole-Parmer | UZ-07909-09 | |
Pipettor 5 mL | Cole-Parmer | UZ-07859-30 | |
Tryptic Soy Broth | Millipore | 22091 | Suitable for microbiology |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены