בידוד ותרבית של מקרופאגים סינוביאליים ראשוניים ופיברובלסטים מרקמת דלקת מפרקים מורין

Summary

המחקר הנוכחי מספק פרוטוקול שונה לבידוד מקרופאגים סינוביאליים ופיברובלסטים מרקמת דלקת מפרקים דלקתית מורין.

Abstract

דלקת מפרקים שגרונית היא מחלה אוטואימונית המובילה לדלקת כרונית של המפרקים. מקרופאגים סינוביאליים ופיברובלסטים סינוביאליים ממלאים תפקידים מרכזיים בפתוגנזה של דלקת מפרקים שגרונית. חשוב להבין את תפקידיהן של שתי אוכלוסיות התאים כדי לחשוף את המנגנונים העומדים בבסיס התקדמות פתולוגית והפוגה בדלקת מפרקים דלקתית. באופן כללי, תנאי ניסוי חוץ גופיים צריכים לחקות את הסביבה in vivo ככל האפשר. תאים ראשוניים שמקורם ברקמה שימשו בניסויים המאפיינים פיברובלסטים סינוביאליים בדלקת פרקים. לעומת זאת, בניסויים שחקרו את התפקודים הביולוגיים של מקרופאגים בדלקת מפרקים דלקתית, נעשה שימוש בקווי תאים, מקרופאגים שמקורם במח עצם ומקרופאגים שמקורם במונוציטים בדם. עם זאת, לא ברור אם מקרופאגים כאלה אכן משקפים את תפקודם של מקרופאגים שוכני רקמות. כדי להשיג מקרופאגים מקומיים, פרוטוקולים קודמים שונו כדי לבודד ולהרחיב הן מקרופאגים ראשוניים והן פיברובלסטים מרקמה סינוביאלית במודל עכבר של דלקת מפרקים דלקתית. תאים סינוביאליים ראשוניים אלה עשויים להיות שימושיים לניתוח חוץ גופי של דלקת מפרקים דלקתית.

Introduction

דלקת מפרקים שגרונית (RA) היא מחלה אוטואימונית המאופיינת בהיפרפלזיה של הסינוביום, המובילה להרס מפרקים ^1,2. מקרופאגים ופיברובלסטים שומרי רקמות נמצאים בסינוביום בריא כדי לשמור על הומאוסטזיס משותף. בחולי RA, פיברובלסטים סינוביאליים (SFs) מתרבים, ותאים חיסוניים, כולל מונוציטים, מסתננים לתוך סינוביום ונוזל המפרקים, תהליכים הקשורים לדלקת ^1,3,4. מקרופאגים סינוביאליים (SMs), הכוללים מקרופאגים תושבים ומקרופאגים היקפיים שמקורם במונוציטים בדם, ו-SFs מופעלים באופן חריג ויש להם תפקידים חשובים בפתוגנזה של RA. מחקרים אחרונים הראו כי אינטראקציות תא-תא בין SMs ו- SFs תורמות הן להחמרה והן להפוגה של RA ^5,6.

כדי להבין את הפתוגנזה של RA, נעשה שימוש במספר מודלים של מכרסמים של דלקת מפרקים דלקתית, כולל דלקת מפרקים בנסיוב K/BxN, דלקת מפרקים הנגרמת על ידי קולגן ודלקת מפרקים הנגרמת על ידי נוגדני קולגן. בדיקות מבוססות תאים נדרשות בדרך כלל כדי להבהיר פונקציות מולקולריות בדלקת פרקים. לכן, תאים ראשוניים ממודלים של בעלי חיים של דלקת פרקים בודדו. השיטה לבידוד SFs מרקמת דלקת מפרקים מורין מבוססת היטב, ותאים אלה תרמו להבהרת מנגנונים מולקולריים בפתוגנזה של דלקת פרקים ^7,8. מצד שני, מקרופאגים שמקורם במח עצם, מקרופאגים שמקורם במונוציטים בדם וקווי תאי מקרופאגים שימשו לעתים קרובות כמשאבי מקרופאגים למחקרי דלקת פרקים ^9,10. מאחר שמקרופאגים יכולים לרכוש תפקודים הקשורים למיקרו-סביבה שלהם, מקורות כלליים של מקרופאגים עשויים להיות חסרים תגובות ספציפיות לרקמת דלקת פרקים. בנוסף, קשה להשיג מספיק תאים סינוביאליים על ידי מיון, כמו סינוביום murine היא רקמה קטנה מאוד אפילו מודלים דלקת פרקים. חוסר השימוש במקרופאגים סינוביאליים למחקרי מבחנה היווה מגבלה במחקרי דלקת פרקים. הקמת פרוטוקול לבידוד והרחבה של מקרופאגים סינוביאליים תהווה יתרון להבהרת מנגנונים פתולוגיים ב- RA.

בשיטה הקודמת לבידוד SFs, SMs הושלכו⁷. מלבד זאת, דווח על שיטה לבודד ולהרחיב מקרופאגים מקומיים מאיברים מסוימים¹¹. לכן, פרוטוקולים קיימים שונו בשילוב. השינוי נועד להשיג את התרבות העיקרית של SMs ו- SFs עם טוהר גבוה. המטרה הכוללת של שיטה זו היא לבודד ולהרחיב הן SMs והן SFs מרקמת דלקת מפרקים מורין.

Protocol

ניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת Ehime ובוצעו בהתאם להנחיות אוניברסיטת Ehime לניסויים בבעלי חיים (37A1-1*16).

1. הכנת מכשירים, ריאגנטים ומדיום תרבית

1. הכינו את מדיום התרבית באופן הבא: השלימו את מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) עם 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-1% תמיסה אנטיביוטית-אנטי-מיקוטית (אנטי-אנטי).
2. הכן את מדיום העיכול כדלקמן: להשלים את המדיום תרבית עם 1 מ"ג / מ"ל collagenase סוג IV. יש להתאים את ריכוז ה-collagenase ממש לפני השימוש.
3. יש לדלל קולגן מסוג I-C לריכוז של 0.15 מ"ג/מ"ל בתמיסת HCl של 1 mM. הציפו את כלי התרבית (בקוטר של 40 או 60 מ"מ) בתמיסת הקולגן המדוללת. לאחר 6-12 שעות בטמפרטורת החדר, מוציאים את תמיסת הקולגן מהכלים ומייבשים בטמפרטורת החדר. ניתן לשמור את הכלים המצופים בקולגן בטמפרטורת החדר למשך שבוע אחד לפחות. יש לשטוף את הכלים המצופים מראש במי מלח חוצצים פוספט (PBS) או בינוני לפני השימוש.
4. הכינו כלי ניתוח סטריליים, כגון מספריים, פינצטה עם קצוות משוננים ופינצטה עדינה. יש להשרות 70% אתנול לפני השימוש.

2. הכנת רקמת סינוביטיס בעכברים ( איור 1A)

1. הכינו עכבר עם דלקת מפרקים דלקתית בכפות האחוריות.
   הערה: נקבות עכברי C57BL/6 (18-20 גרם), 7-8 שבועות לאחר הלידה, עם דלקת מפרקים הנגרמת על ידי נוגדני קולגן (CAIA) או דלקת מפרקים בהעברת סרום K/BxN (STA) שימשו לפרוטוקול זה⁸. בידוד SMs מרקמה לא נפוחה (כלומר, בריאה) עשוי להיות קשה, כמו מספר התאים אינו מספיק.
2. מרדימים את העכברים על ידי הזרקה תוך צפקית של 80 מ"ג/ק"ג קטמין ו-16 מ"ג/ק"ג קסילזין. נקו את העכברים עם 70% אתנול.
3. פתח את אזור החזה עם מספריים כדי לחשוף את הלב. חותכים את האפרכסת הימנית של הלב עם מספריים, ולאחר מכן תוקעים מחט פרפר 23 G לחדר השמאלי דרך קודקוד הלב, ואחריו ריפלוקס של 15-20 מ"ל של PBS סטרילי באמצעות מזרק כדי להסיר באופן ידני דם היקפי (כ 1 מ"ל / 2 שניות).
4. נטרלו את הכפות האחוריות על ידי חיתוך העור באמצעות מספריים ומשיכת העור באמצעות פינצטה עם קצוות משוננים.
   הערה: לאחר שלב זה, מומלץ להשתמש בפינצטה לטיפול בדגימות. אין לגעת ברקמה מעוטרת באצבעות, כדי למנוע חיבור של שיער מורין.
5. נקע את המפרקים metatarsophalangeal על ידי משיכה, ואחריו חיתוך הרצועות של המפרקים באמצעות מספריים כדי להסיר את הבהונות.
6. חותכים את הגידים של שרירי הרגליים התחתונות ליד הקרסול באמצעות מספריים. אחזו בגיד בפינצטה וקילפו את השרירים בסמיכות ברגל התחתונה כדי לחשוף את השוקה. הסר את הפיבולה.
7. נקע את מפרק הברך על ידי משיכה, ולאחר מכן חיתוך רצועות המפרקים באמצעות מספריים כדי לנתק את השוקה עם הכף האחורית הנפוחה. שמור את הדגימות בתרבית קרה כקרח בינונית (0.3 מ"ל/ס"מ²) עד לעיבוד לשלב 3.1.

3. עיכול רקמת סינוביטיס ( איור 1B)

1. שאפו את מדיום התרבית, הימנעו מהדגימה, ולאחר מכן הוסיפו מדיום תרבית טרי (0.3 מ"ל/ס"מ²). חזרו על תהליך הכביסה שלוש או ארבע פעמים.
   הערה: משלב זה, הטיפול בדגימות צריך להתבצע באופן אספטי בספסל נקי או בארון בטיחות.
2. נקע את כל מפרקי הדגימות על ידי משיכה באמצעות פינצטה עדינה בתווך התרבית תחת סטריאומיקרוסקופ (בהגדלה של פי 10-20). פינצטה עדינה נוחה בשלב זה. הסירו את השוקה וכמה שיותר כלי דם, גידים ורצועות. היזהר לא לשבור את העצמות בעת פריקה.
3. הכינו שתי שפופרות של 15 מ"ל לדגימה. מעבירים את העצמות המנותקות עם רקמות רכות לצינור הראשון של 15 מ"ל באמצעות פינצטה. הוסף 4 מ"ל של מדיום העיכול לכל דגימה, המתקבל משתי הכפות האחוריות, לתוך הצינור.
4. כדי לאסוף תאים שיוריים ושברי רקמות, להעביר את המדיום שבו הדגימה נכללה לצינור השני 15 מ"ל. צנטריפוגה את המדיום ב 500 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הסרת supernatant, resuspend את הגלולה עם 1 מ"ל של מדיום העיכול ולהעביר את תמיסת התא ואת מקטע הרקמה לצינור הראשון 15 מ"ל המכיל כמעט את כל הרקמה (סה"כ 5 מ"ל של עיכול בינוני / כפות אחוריות).
5. לעכל את הדגימה במשך 60-120 דקות ב 37 ° C עם ניעור בתנור היברידי.
   הערה: יש להחליט על הזמן האופטימלי לעיכול הדגימות. הזמן תלוי במידת הנפיחות בקרסוליים ובקולגנאזות. ברוב המקרים, 60-120 דקות מספיק. לאחר 60 דקות של דגירה, לאסוף חלק מהדגימה מעוכל על ידי pipetting, ולצפות תחת מיקרוסקופ. אם העיכול אינו מספיק, הדגירה צריכה להמשיך, ואת העיכול נבדק כל 30 דקות.
6. מפטפט היטב את הפתרון. סנן את תמיסת התא דרך מסננת תאים (גודל נקבוביות 40 מיקרומטר) לצינור של 50 מ"ל.
7. הוסף 10 מ"ל של מדיום תרבית לצינור 50 מ"ל דרך מסננת התא. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
8. לאחר הסרת supernatant, resuspend עם 10 מ"ל של מדיום תרבות. חזור על הצנטריפוגה. לאחר הסרת supernatant, resuspend עם 2 מ"ל של מדיום תרבות.

איור 1: הליך הדגימה של רקמת דלקת מפרקים מורין ועיכול קולגנאז . (A) (i) כף אחורית מורין עם דלקת מפרקים דלקתית. (ii) הסרת העור בכפה האחורית. (iii) נקע של המפרקים metatarsophalangeal והסרת הבהונות. (4) חיתוך הגידים בקרסול. (v) הסרת השרירים ברגליים התחתונות. (vi) נקע של מפרק הברך. (ב) שמאל; רגליים נכרתו במדיום התרבות. ימין; נקע tarsus ו metatarsus במדיום תרבית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

4. בידוד של פיברובלסטים סינוביאליים ( איור 2A)

1. זרעו את כל מתלי התאים המתקבלים משני הקרסוליים על צלחת מצופה קולגן.
   הערה: אם משתמשים בקרסוליים עם נפיחות חלשה או בינונית כדי להשיג את התאים, מוחלים צלחת בקוטר 40 מ"מ. ניתן לשנות את גודל הכלי המצופה בקולגן לצלחת בקוטר 60 מ"מ אם לשני הקרסוליים יש נפיחות חמורה.
2. מוסיפים מדיום תרבית (כ-222 מיקרוליטר/ס"מ²). יש לדגור במשך שעה אחת ב-37°C (75 °F) באווירה לחה עם 5% CO_2.
3. אסוף תאים שאינם דבקים באמצעות פיפט (השתמש בשלב 5.1). שוטפים את הכלי המצופה בקולגן במדיום תרבית ואוספים את המדיום. תרבית את התאים הדבקים בתווך טרי (איור 2B,i). רוב התאים שנצמדים במהירות לצלחת מצופה הקולגן מציגים מורפולוגיה פיברובלסטואידית (בצורת ציר).
4. מעבר תאים תת-משתלבים על ידי טיפול ב-0.05% טריפסין בתמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS). בשיטה זו, הזיהום של תאים אחרים מוגבל, גם אם בהרחבה הראשונית. אם נדרשים תאים מטוהרים יותר דמויי פיברובלסט, בצע מעברים חוזרים ונשנים כדי לאפשר שיפור של טוהר; אולם נצפתה גם התרחבות הציטופלסמה של התאים בהידבקות (איור 2B,ii). מכיוון שמעברים מוגזמים משפיעים על אובדן תכונות נאיביות בתאים, השתמשו בתאים עם פחות מ-5 מעברים.

5. בידוד מקרופאגים סינוביאליים ( איור 2A)

1. זרעו את כל התאים שאינם נדבקים משלב 4.4 על צלחות (קוטר של 40 או 60 מ"מ) שלא צופו בקולגן.
   הערה: תאים שאינם דבקים כוללים מקרופאגים, לימפוציטים אחרים ושאריות פיברובלסטים מרקמת סינוביטיס.
2. תרבית את התאים בתפזורת במשך יום אחד ב 37 ° C באווירה לחה עם 5% CO₂.
3. כדי להסיר לימפוציטים שאינם דבקים, לשאוף את המדיום בתרבית, ולאחר מכן להוסיף מדיום תרבית טרי. חזרו על התהליך הזה פעמיים או שלוש (איור 2B,iii).
4. תרבית את התאים הדבקים בתפזורת במשך שבוע-שבועיים בתווך התרבית, עם שינויים בינוניים כל יומיים תוך שמירה על מפגש (איור 2B,iv).
   הערה: מספר הודעות SM גדל לאט בתנאי תרבות משותפת עם SFs. לפיכך, יש להתאים את תקופת התרבות המשותפת לפי הצורך.
5. יש לשטוף עם PBS או HBSS פעמיים. יש לטפל עם 0.05% טריפסין ב-HBSS (כ-55 מיקרוליטר/ס"מ 2) למשך 3 דקות ב-37°C באווירה לחה עם 5% CO₂. פיברובלסטים מתנתקים בקלות מצלחת התרבית על ידי טיפול בטריפסין, ומקרופאגים מפגינים עמידות לטיפול בטריפסין. השתמש במאפיין זה לבחירת מקרופאגים סינוביאליים.
6. יש להוסיף מדיום תרבית (כ-222 מיקרוליטר/ס"מ²) בעדינות ל-0.05% טריפסין ב-HBSS. לאחר שלב זה, אין לשפוך את המדיום ישירות על התאים.
7. כדי להסיר תאים מנותקים, שאפו את המדיום התרבית, ולאחר מכן הוסיפו מדיום תרבית טרי בעדינות. חזור על תהליך זה פעמיים או שלוש. שמרו את התאים הנותרים על הצלחת בתרבית טרייה עד לשימוש (איור 2B,v).
   הערה: לאחר טיפול בטריפסין, תאים דבקים מפגינים מאפיינים מורפולוגיים דמויי מקרופאגים.

איור 2: הפרדה של שברים עשירים במקרופאגים ועשירים בפיברובלסטים מרקמת דלקת מפרקים דלקתית. (A) סכימה של ההליך להפרדת תאים עשירים במקרופאגים ועשירים בפיברובלסטים מרקמת דלקת פרקים. (B) תמונות ניגודיות פאזה מייצגות של שלבי ההליך, (i) עד (v) באיור 2A. סרגל קנה המידה מייצג 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תוצאות

נקבות עכברי C57BL/6 בגיל 7-8 שבועות עברו דלקת מפרקים הנגרמת על ידי נוגדני קולגן. תאים דמויי מקרופאגים ותאים דמויי פיברובלסטים בודדו באופן עצמאי מרקמת דלקת מפרקים דלקתית בהתאם להליך שתואר לעיל (איור 2A,B). תאים דמויי מקרופאגים שימשו מיד לאחר שלב 5.7. תאים דמויי פיברובלסטים...

Discussion

שיטה זו שפותחה כאן משפרת טכניקות קודמות לבידוד הן SFs מדלקת מפרקים מורין והן מקרופאגים תושבים ממספר איברים ^7,11. השיטה המתוקנת יכולה לבודד הן מקרופאגים והן פיברובלסטים מסינוביום דלקתי עם טוהר גבוה, והיא פשוטה וניתנת לשחזור. מכיוון שהשיטה אינה דורשת מכשירים מו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5.0 g/L Trypsin/5.3 mmol/L EDTA solution	nacalai tesque	35556-44	Diluted with HBSS
Antibiotic–antimycotic (anti/anti)	Gibco	15240-062
Butterfly needle	TERUMO	SV-23DLK	23G
Cell strainer	Falcon	352340	40 µm pore, Nylon
Cellmatrix Type I-C	Nitta gelatin	637-00773	Type I-C collagen
Centriguge tube 15	TPP	91014	15 mL tube
Centriguge tube 50	TPP	91050	50 mL tube
Collagenase from C. Histolyticum	Sigma	C5138	Type IV collagenase
Dulbecco’s Modified Eagle Medium GlutaMax (DMEM)	Gibco	10569-010
Fetal bovine serum (FBS)	SIGAM	173012	Heat inactivation was performed
Hanks' balanced salt solution (HBSS)	Wako	085-09355
Scissors	Bio Research Center	PRI28-1525A
Tissue culture dish 40	TPP	93040	For cell culture
Tissue culture dish 60	TPP	92006	For cell culture
Tweezers	KFI	1-9749-31	Fine-point
Tweezers	Bio Research Center	PRI28-1522	Serrated tip
ZEISS Stemi 305	ZEISS	STEMI305-EDU	Stereomicroscope