쥐 관절염 조직에서 Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts의 분리 및 배양

요약

본 연구는 쥐의 염증성 관절염 조직으로부터 활막 대식세포 및 섬유아세포를 분리하기 위한 수정된 프로토콜을 제공한다.

초록

류마티스 관절염은 관절의 만성 염증을 유발하는자가 면역 질환입니다. 활막 대식세포와 활막 섬유아세포는 류마티스 관절염의 발병기전에서 중심적인 역할을 합니다. 염증성 관절염의 병리학적 진행과 완화의 기본 메커니즘을 밝히기 위해 두 세포 집단의 기능을 이해하는 것이 중요합니다. 일반적으로, 시험관 내 실험 조건은 가능한 한 생체내 환경을 모방해야 한다. 일차 조직 유래 세포는 관절염에서 활막 섬유아세포를 특성화하는 실험에 사용되었습니다. 이에 반해 염증성 관절염에서 대식세포의 생물학적 기능을 조사하는 실험에서는 세포주, 골수 유래 대식세포, 혈액 단핵구 유래 대식세포를 사용하였다. 그러나, 이러한 대식세포가 실제로 조직에 상주하는 대식세포의 기능을 반영하는지 여부는 불분명하다. 상주하는 대식세포를 얻기 위해, 이전 프로토콜은 염증성 관절염 마우스 모델에서 활막 조직에서 일차 대식세포와 섬유아세포를 모두 분리하고 확장하도록 수정되었습니다. 이러한 일차 활막 세포는 염증성 관절염의 시험관내 분석에 유용할 수 있습니다.

서문

류마티스 관절염 (RA)은 활액막의 증식을 특징으로하는자가 면역 질환으로 관절 파괴를 유발합니다 ^1,2. 조직에 상주하는 대식세포와 섬유아세포는 관절 항상성을 유지하기 위해 건강한 활막에 존재합니다. RA 환자에서, 활막 섬유아세포(SFs)가 증식하고, 단핵구를 포함한 면역 세포가 활막 및 관절액으로 침윤하며, 염증과 관련된 과정이다 ^1,3,4. 상주 대식세포 및 말초 혈액 단핵구 유래 대식세포를 포함하는 활막 대식세포(SM) 및 SF는 비정상적으로 활성화되며 RA 발병기전에서 중요한 역할을 합니다. 최근 연구에 따르면 SM과 SF 사이의 세포-세포 상호작용은 RA ^5,6의 악화 및 완화 모두에 기여합니다.

RA 발병기전을 이해하기 위해 K/BxN 혈청 전달 관절염, 콜라겐 유도 관절염 및 콜라겐 항체 유도 관절염을 포함하여 염증성 관절염의 여러 설치류 모델이 사용되었습....

프로토콜

동물을 대상으로 한 실험은 에히메대학 동물실험위원회의 승인을 받아 에히메대학 동물실험 지침(37A1-1*16)에 따라 실시했습니다.

1. 기구, 시약 및 배양액의 준비

1. 다음과 같이 배양 배지를 준비합니다: Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)에 10% 소 태아 혈청(FBS)과 1% 항생제-항진균 용액(항-항균제)을 보충합니다.
2. 다음과 같이 소화 배지를 준비합니다: 배양 배지에 1mg/mL 콜라게나제 유형 IV를 보충합니다. 사용 직전에 콜라게나제 농도를 조절하십시오.
3. 유형 I-C 콜라겐을 0.15mM HCl 용액으로 1mg/mL 농도로 희석합니다. 홍수 배양 접시 (직경 40 또는 60 mm)에 희석 된 콜라겐 용액을 넣습니다. 실온에서 6-12 시간 후, 접시에서 콜라겐 용액을 제거하고 실온에서 건조시킵니다. 콜라겐으로 코팅된 접시는 실온에서 최소 1주일 동안 보관할 수 있습니다. 사용하기 전에 미리 코팅된 접시를 인산염 완충 식염수(PBS) 또는 배지로 세척하십시오.
4. 가위, 끝이 톱니 모양의 핀셋, 가는 핀셋과 같은 멸균 수술 기구를 준비합니다. 사용하기 전에 70% 에탄올에 담그십시오.

....

토론

여기에서 개발된 이 방법은 쥐 관절염으로부터 SF와 다수의 장기로부터 상주하는 대식세포를 분리하기 위한 이전의 기술들을 개선한다 ^7,11. 변형된 방법은 염증성 활막에서 대식세포와 섬유아세포를 모두 고순도로 분리할 수 있으며 간단하고 재현성이 있습니다. 이 방법은 세포 분류기와 같은 복잡한 도구가 필요하지 않기 때문에 누구나 수행 할 수 있.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
5.0 g/L Trypsin/5.3 mmol/L EDTA solution	nacalai tesque	35556-44	Diluted with HBSS
Antibiotic–antimycotic (anti/anti)	Gibco	15240-062
Butterfly needle	TERUMO	SV-23DLK	23G
Cell strainer	Falcon	352340	40 µm pore, Nylon
Cellmatrix Type I-C	Nitta gelatin	637-00773	Type I-C collagen
Centriguge tube 15	TPP	91014	15 mL tube
Centriguge tube 50	TPP	91050	50 mL tube
Collagenase from C. Histolyticum	Sigma	C5138	Type IV collagenase
Dulbecco’s Modified Eagle Medium GlutaMax (DMEM)	Gibco	10569-010
Fetal bovine serum (FBS)	SIGAM	173012	Heat inactivation was performed
Hanks' balanced salt solution (HBSS)	Wako	085-09355
Scissors	Bio Research Center	PRI28-1525A
Tissue culture dish 40	TPP	93040	For cell culture
Tissue culture dish 60	TPP	92006	For cell culture
Tweezers	KFI	1-9749-31	Fine-point
Tweezers	Bio Research Center	PRI28-1522	Serrated tip
ZEISS Stemi 305	ZEISS	STEMI305-EDU	Stereomicroscope