Isolierung und Kultivierung von primären Synovialmakrophagen und Fibroblasten aus murinem Arthritisgewebe

Zusammenfassung

Die vorliegende Studie bietet ein modifiziertes Protokoll zur Isolierung von Synovialmakrophagen und Fibroblasten aus murinem entzündlichem Arthritisgewebe.

Zusammenfassung

Rheumatoide Arthritis ist eine Autoimmunerkrankung, die zu chronischen Entzündungen der Gelenke führt. Synovialmakrophagen und synoviale Fibroblasten spielen eine zentrale Rolle in der Pathogenese der rheumatoiden Arthritis. Es ist wichtig, die Funktionen beider Zellpopulationen zu verstehen, um die Mechanismen aufzudecken, die dem pathologischen Fortschreiten und der Remission bei entzündlicher Arthritis zugrunde liegen. Im Allgemeinen sollten In-vitro-Versuchsbedingungen die In-vivo-Umgebung so weit wie möglich nachahmen. Aus dem Primärgewebe gewonnene Zellen wurden in Experimenten zur Charakterisierung von Synovialfibroblasten bei Arthritis verwendet. Im Gegensatz dazu wurden in Experimenten, in denen die biologischen Funktionen von Makrophagen bei entzündlicher Arthritis untersucht wurden, Zelllinien, aus dem Knochenmark stammende Makrophagen und aus Blutmonozyten gewonnene Makrophagen verwendet. Es ist jedoch unklar, ob solche Makrophagen tatsächlich die Funktionen von geweberesidenten Makrophagen widerspiegeln. Um residente Makrophagen zu erhalten, wurden frühere Protokolle modifiziert, um sowohl primäre Makrophagen als auch Fibroblasten aus Synovialgewebe in einem Mausmodell für entzündliche Arthritis zu isolieren und zu expandieren. Diese primären Synovialzellen können für die In-vitro-Analyse von entzündlicher Arthritis nützlich sein.

Einleitung

Rheumatoide Arthritis (RA) ist eine Autoimmunerkrankung, die durch eine Hyperplasie der Synovialfunktion gekennzeichnet ist und zur Zerstörung der Gelenke führt ^1,2. Geweberesidente Makrophagen und Fibroblasten sind in gesunden Synovialen vorhanden, um die gemeinsame Homöostase aufrechtzuerhalten. Bei RA-Patienten vermehren sich synoviale Fibroblasten (SFs), und Immunzellen, einschließlich Monozyten, infiltrieren in die Synovial- und Gelenkflüssigkeit, Prozesse, die mit Entzündungen verbunden^sind 1,3,4. Synoviale Makr....

Protokoll

Tierversuche wurden vom Tierversuchskomitee der Universität Ehime genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien für Tierversuche der Universität Ehime (37A1-1*16) durchgeführt.

1. Vorbereitung von Instrumenten, Reagenzien und Nährmedium

1. Bereiten Sie das Nährmedium wie folgt vor: Ergänzen Sie Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS) und 1 % antibiotisch-antimykotischer Lösung (Anti-Anti).
2. Bereiten Sie das Verdauungsmedium wie folgt vor: Ergänzen Sie das Nährmedium mit 1 mg/ml Kollagenase Typ IV. Passen Sie die Kollagenasekonzentration kurz vor der Anwendung an.
....

Diskussion

Diese hier entwickelte Methode verbessert frühere Techniken zur Isolierung sowohl von SFs aus muriner Arthritis als auch residenter Makrophagen aus einer Reihe von Organen ^7,11. Die modifizierte Methode kann sowohl Makrophagen als auch Fibroblasten mit hoher Reinheit aus entzündlichen Synovialen isolieren, ist einfach und reproduzierbar. Da die Methode keine komplexen Instrumente wie einen Zellsortierer benötigt, kann sie von jedem durchgeführt werden. Darüb.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
5.0 g/L Trypsin/5.3 mmol/L EDTA solution	nacalai tesque	35556-44	Diluted with HBSS
Antibiotic–antimycotic (anti/anti)	Gibco	15240-062
Butterfly needle	TERUMO	SV-23DLK	23G
Cell strainer	Falcon	352340	40 µm pore, Nylon
Cellmatrix Type I-C	Nitta gelatin	637-00773	Type I-C collagen
Centriguge tube 15	TPP	91014	15 mL tube
Centriguge tube 50	TPP	91050	50 mL tube
Collagenase from C. Histolyticum	Sigma	C5138	Type IV collagenase
Dulbecco’s Modified Eagle Medium GlutaMax (DMEM)	Gibco	10569-010
Fetal bovine serum (FBS)	SIGAM	173012	Heat inactivation was performed
Hanks' balanced salt solution (HBSS)	Wako	085-09355
Scissors	Bio Research Center	PRI28-1525A
Tissue culture dish 40	TPP	93040	For cell culture
Tissue culture dish 60	TPP	92006	For cell culture
Tweezers	KFI	1-9749-31	Fine-point
Tweezers	Bio Research Center	PRI28-1522	Serrated tip
ZEISS Stemi 305	ZEISS	STEMI305-EDU	Stereomicroscope