小鼠关节炎组织中原代滑膜巨噬细胞和成纤维细胞的分离和培养

摘要

本研究提供了一种改进的方案，用于从小鼠炎性关节炎组织中分离滑膜巨噬细胞和成纤维细胞。

摘要

类风湿性关节炎是一种自身免疫性疾病，会导致关节慢性炎症。滑膜巨噬细胞和滑膜成纤维细胞在类风湿性关节炎的发病机制中起核心作用。重要的是要了解两个细胞群的功能，以揭示炎症性关节炎病理进展和缓解的机制。一般来说， 体外 实验条件应尽可能模仿 体内 环境。原代组织来源细胞已被用于表征关节炎滑膜成纤维细胞的实验。相反，在研究巨噬细胞在炎症性关节炎中的生物学功能的实验中，已经使用了细胞系、骨髓来源的巨噬细胞和血单核细胞来源的巨噬细胞。然而，目前尚不清楚这些巨噬细胞是否真的反映了组织驻留巨噬细胞的功能。为了获得常驻巨噬细胞，修改了先前的方案以在炎性关节炎小鼠模型中从滑膜组织中分离和扩增原代巨噬细胞和成纤维细胞。这些原代滑膜细胞可用于炎症性关节炎的 体外 分析。

引言

类风湿性关节炎（RA）是一种自身免疫性疾病，其特征是滑膜增生，导致^{关节破坏1,2}。组织驻留的巨噬细胞和成纤维细胞存在于健康的滑膜中，以维持关节稳态。在 RA 患者中，滑膜成纤维细胞 （SF） 增殖，免疫细胞（包括单核细胞）浸润到滑膜和关节液中，与炎症相关的过程 ^1,3,4。滑膜巨噬细胞 （SM），包括常驻巨噬细胞和外周血单核细胞来源的巨噬细胞，以及 SF 异常激活，在 RA 发病机制中起重要作用。最近的研究表明，SM和SF之间的细胞间相互作用有助于RA ^5,6的恶化和缓解。

为了了解RA的发病机制，已经使用了几种啮齿动物的炎症性关节炎模型，包括K/BxN血清转移关节炎、胶原蛋白诱导的关节炎和胶原抗体诱导的关节炎。通常需要基于细胞的测定来阐明关节炎的分子功能。因此，已经分离出关节炎动物模型中的原代细胞。从小鼠关节炎组织中分离SFs的方法已经建立，这些细胞有助于阐明关节炎发病机制中的分子机制^7,8

研究方案

涉及动物的实验经爱媛大学动物实验委员会批准，并按照爱媛大学动物实验指南（37A1-1*16）进行。

1. 仪器、试剂和培养基的制备

1. 按如下方式制备培养基：用10%胎牛血清（FBS）和1%抗生素 - 抗真菌溶液（抗抗）补充Dulbecco的改良鹰培养基（DMEM）。
2. 按如下方式制备消化培养基：用1mg / mLIV型胶原酶补充培养基。使用前调整胶原酶浓度。
3. 用 1 mM HCl 溶液稀释 I-C 型胶原蛋白至 0.15 mg/mL 的浓度。用稀释的胶原蛋白溶液淹没培养皿（直径40或60毫米）。在室温下6-12小时后，从培养皿中取出胶原蛋白溶液并在室温下干燥。涂有胶原蛋白的培养皿可以在室温下保存至少 1 周。使用前用磷酸盐缓冲盐水（PBS）或培养基清洗预涂布的餐具。
4. 准备无菌手术器械，如剪刀、带锯齿尖端的镊子和细尖镊子。使用前浸泡在70%乙醇中。

2.小鼠滑膜炎组织的制备（ 图1A）

1. 准备一只后爪有炎症性关节炎的小鼠。
   注意：雌性C57BL / 6小鼠（18-20g），出生后7-8周，胶原蛋白抗体诱导的关节炎（CAIA）或K / BxN血清转移关节炎....

讨论

这里开发的这种方法改进了以前从小鼠关节炎中分离SF和从许多器官中分离常驻巨噬细胞的技术^7,11。改进的方法可以从炎性滑膜中分离出巨噬细胞和成纤维细胞，纯度高，简单易重复。由于该方法不需要细胞分选仪等复杂仪器，因此任何人都可以进行。此外，本技术避免了与其他方法相关的问题，例如荧光激活细胞分选（FACS）和磁激活细胞分选（MACS）.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5.0 g/L Trypsin/5.3 mmol/L EDTA solution	nacalai tesque	35556-44	Diluted with HBSS
Antibiotic–antimycotic (anti/anti)	Gibco	15240-062
Butterfly needle	TERUMO	SV-23DLK	23G
Cell strainer	Falcon	352340	40 µm pore, Nylon
Cellmatrix Type I-C	Nitta gelatin	637-00773	Type I-C collagen
Centriguge tube 15	TPP	91014	15 mL tube
Centriguge tube 50	TPP	91050	50 mL tube
Collagenase from C. Histolyticum	Sigma	C5138	Type IV collagenase
Dulbecco’s Modified Eagle Medium GlutaMax (DMEM)	Gibco	10569-010
Fetal bovine serum (FBS)	SIGAM	173012	Heat inactivation was performed
Hanks' balanced salt solution (HBSS)	Wako	085-09355
Scissors	Bio Research Center	PRI28-1525A
Tissue culture dish 40	TPP	93040	For cell culture
Tissue culture dish 60	TPP	92006	For cell culture
Tweezers	KFI	1-9749-31	Fine-point
Tweezers	Bio Research Center	PRI28-1522	Serrated tip
ZEISS Stemi 305	ZEISS	STEMI305-EDU	Stereomicroscope