Isolamento e Cultura de Macrófagos e Fibroblastos Sinoviais Primários de Tecido de Artrite Murina

Resumo

O presente estudo fornece um protocolo modificado para isolar macrófagos sinoviais e fibroblastos do tecido da artrite inflamatória murina.

Resumo

A artrite reumatoide é uma doença autoimune que leva à inflamação crônica das articulações. Macrófagos sinoviais e fibroblastos sinoviais têm papel central na patogênese da artrite reumatoide. É importante compreender as funções de ambas as populações celulares para revelar os mecanismos subjacentes à progressão patológica e remissão na artrite inflamatória. Em geral, as condições experimentais in vitro devem mimetizar ao máximo o ambiente in vivo . Células derivadas de tecidos primários têm sido utilizadas em experimentos caracterizando fibroblastos sinoviais em artrite. Em contraste, em experimentos investigando as funções biológicas de macrófagos em artrite inflamatória, linhagens celulares, macrófagos derivados da medula óssea e macrófagos derivados de monócitos sanguíneos têm sido usados. No entanto, não está claro se tais macrófagos realmente refletem as funções dos macrófagos residentes no tecido. Para a obtenção de macrófagos residentes, protocolos prévios foram modificados para isolar e expandir macrófagos primários e fibroblastos do tecido sinovial em um modelo de artrite inflamatória em camundongos. Essas células sinoviais primárias podem ser úteis para a análise in vitro da artrite inflamatória.

Introdução

A artrite reumatoide (AR) é uma doença autoimune caracterizada por hiperplasia da sinóvia, levando à destruição^articular1,2. Macrófagos e fibroblastos residentes no tecido estão presentes na sinóvia saudável para manter a homeostase articular. Em pacientes com AR, fibroblastos sinoviais (FSs) proliferam e células imunes, incluindo monócitos, infiltram-se na sinóvia e no fluido articular, processos associados à inflamação ^1,3,4. Macrófagos sinoviais (SMs), que incluem macrófagos residentes e macrófagos derivados de mon....

Protocolo

Experimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê de Experimentação Animal da Universidade de Ehime e foram realizados de acordo com as Diretrizes da Universidade de Ehime para Experimentos com Animais (37A1-1*16).

1. Preparação de instrumentos, reagentes e meio de cultura

1. Preparar o meio de cultura da seguinte forma: suplementar o meio Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de solução antibiótico-antimicótica (anti-anti).
2. Preparar o meio de digestão da seguinte forma: complementar o meio de cultura com 1 mg/mL de colagenase tipo IV. Ajuste a concentraçã....

Discussão

Este método aqui desenvolvido aprimora técnicas anteriores para isolar tanto as FS de artrite murina quanto os macrófagos residentes de vários ^órgãos7,11. O método modificado pode isolar macrófagos e fibroblastos da sinóvia inflamatória com alta pureza, sendo simples e reprodutível. Como o método não requer instrumentos complexos, como um classificador de células, qualquer pessoa pode conduzi-lo. Além disso, a presente técnica evita preocupações.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
5.0 g/L Trypsin/5.3 mmol/L EDTA solution	nacalai tesque	35556-44	Diluted with HBSS
Antibiotic–antimycotic (anti/anti)	Gibco	15240-062
Butterfly needle	TERUMO	SV-23DLK	23G
Cell strainer	Falcon	352340	40 µm pore, Nylon
Cellmatrix Type I-C	Nitta gelatin	637-00773	Type I-C collagen
Centriguge tube 15	TPP	91014	15 mL tube
Centriguge tube 50	TPP	91050	50 mL tube
Collagenase from C. Histolyticum	Sigma	C5138	Type IV collagenase
Dulbecco’s Modified Eagle Medium GlutaMax (DMEM)	Gibco	10569-010
Fetal bovine serum (FBS)	SIGAM	173012	Heat inactivation was performed
Hanks' balanced salt solution (HBSS)	Wako	085-09355
Scissors	Bio Research Center	PRI28-1525A
Tissue culture dish 40	TPP	93040	For cell culture
Tissue culture dish 60	TPP	92006	For cell culture
Tweezers	KFI	1-9749-31	Fine-point
Tweezers	Bio Research Center	PRI28-1522	Serrated tip
ZEISS Stemi 305	ZEISS	STEMI305-EDU	Stereomicroscope