マウス関節炎組織からの初代滑膜マクロファージおよび線維芽細胞の単離と培養

要約

本研究は、マウス炎症性関節炎組織から滑膜マクロファージおよび線維芽細胞を単離するための修正されたプロトコルを提供する。

要約

関節リウマチは、関節の慢性炎症を引き起こす自己免疫疾患です。滑膜マクロファージと滑膜線維芽細胞は、関節リウマチの病因において中心的な役割を果たしています。炎症性関節炎の病理学的進行と寛解の根底にあるメカニズムを明らかにするために、両方の細胞集団の機能を理解することが重要です。一般に、インビ トロ 実験条件は、 可能な限りインビボ 環境を模倣すべきである。初代組織由来細胞は、関節炎における滑膜線維芽細胞を特徴付ける実験に使用されています。これに対し、炎症性関節炎におけるマクロファージの生物学的機能を調べる実験では、細胞株、骨髄由来マクロファージ、血中単球由来マクロファージが用いられてきた。しかし、このようなマクロファージが実際に組織常在性マクロファージの機能を反映しているかどうかは不明である。常在性マクロファージを得るために、以前のプロトコルは、炎症性関節炎マウスモデルにおいて滑膜組織から一次マクロファージおよび線維芽細胞の両方を単離および増殖するように改変された。これらの初代滑膜細胞は、炎症性関節炎の インビトロ 分析に有用であり得る。

概要

関節リウマチ(RA)は、滑膜の過形成を特徴とする自己免疫疾患であり、関節破壊につながります^1,2。組織に常在するマクロファージと線維芽細胞は、関節の恒常性を維持するために健康な滑膜に存在します。RA患者では、滑膜線維芽細胞(SF)が増殖し、単球を含む免疫細胞が滑膜および関節液に浸潤し、炎症に関連するプロセスである^1,3,4。常在マクロファージや末梢血単球由来マクロファージを含む滑膜マクロファージ(SM)やSFは異常に活性化され、RAの病態形成に重要な役割を果たしています。最近の研究では、SMとSFの間の細胞間相互作用がRA^の増悪と寛解の両方に寄与することが示唆されています^5,6。

RAの病因を理解するために、K / BxN血清転移関節炎、コラーゲン誘発性関節炎、コラーゲン抗体誘発性関節炎など、炎症性関節炎のいくつかのげっ歯類モデルが使用されています。細胞ベースのアッセイは、関節炎の分子機能を明らかにするために一般的に必要とされています。したがって、関節炎の動物....

プロトコル

動物を用いた実験は、愛媛大学動物実験委員会の承認を受け、愛媛大学動物実験ガイドライン(37A1-1※16)に従って実施しました。

1. 機器、試薬、培地の調製

1. 以下のように培地を調製します:ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)に10%ウシ胎児血清(FBS)と1%抗生物質抗真菌溶液(抗抗)を補給します。
2. 消化培地を次のように調製します:培地に1 mg/mLのコラゲナーゼIV型を補充します。使用直前にコラゲナーゼ濃度を調整してください。
3. I-C型コラーゲンを1 mM HCl溶液で0.15 mg/mLの濃度に希釈します。培養皿(直径40または60 mm)を希釈コラーゲン溶液で浸水させる。室温で6〜12時間後、皿からコラーゲン溶液を取り除き、室温で乾燥させます。コラーゲンコーティングされた皿は、少なくとも1週間室温に保つことができます。使用前に、プレコートされた皿をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)または培地で洗ってください。
4. はさみ、鋸歯状の先端を持つピンセット、細いピンセットなどの滅菌手術器具を準備します。使用前に70%エタノールに浸してください。

2.マウスにおける滑膜炎組織の調製( 図1A)

ディスカッション

ここで開発されたこの方法は、マウス関節炎からのSFと多数の臓器からの常在マクロファージの両方を単離するための以前の技術を改良したものです^7,11。改変法は、炎症性滑膜からマクロファージと線維芽細胞の両方を高純度で単離することができ、簡便で再現性があります。セルソーターなどの複雑な器具を必要としないため、誰でも実施でき?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5.0 g/L Trypsin/5.3 mmol/L EDTA solution	nacalai tesque	35556-44	Diluted with HBSS
Antibiotic–antimycotic (anti/anti)	Gibco	15240-062
Butterfly needle	TERUMO	SV-23DLK	23G
Cell strainer	Falcon	352340	40 µm pore, Nylon
Cellmatrix Type I-C	Nitta gelatin	637-00773	Type I-C collagen
Centriguge tube 15	TPP	91014	15 mL tube
Centriguge tube 50	TPP	91050	50 mL tube
Collagenase from C. Histolyticum	Sigma	C5138	Type IV collagenase
Dulbecco’s Modified Eagle Medium GlutaMax (DMEM)	Gibco	10569-010
Fetal bovine serum (FBS)	SIGAM	173012	Heat inactivation was performed
Hanks' balanced salt solution (HBSS)	Wako	085-09355
Scissors	Bio Research Center	PRI28-1525A
Tissue culture dish 40	TPP	93040	For cell culture
Tissue culture dish 60	TPP	92006	For cell culture
Tweezers	KFI	1-9749-31	Fine-point
Tweezers	Bio Research Center	PRI28-1522	Serrated tip
ZEISS Stemi 305	ZEISS	STEMI305-EDU	Stereomicroscope