אסטרטגיות בקרה וניטור מיקרוביאליות עבור סביבות חדרים נקיים וטיפולים תאיים

Summary

הפרוטוקול מסכם את שיטות העבודה המומלצות למזעור העומס הביולוגי המיקרוביאלי בסביבת חדר נקי וכולל אסטרטגיות כגון ניטור סביבתי, ניטור תהליכים ובדיקת סטריליות מוצרים. הוא רלוונטי למתקני ייצור ובדיקה הנדרשים לעמוד בתקני פרקטיקה של רקמות טובות ובתקני שיטות ייצור טובות הנוכחיים.

Abstract

תוכנית הוליסטית מתוקפת היטב המשלבת אמצעי ניקוי, ניטור סביבתי וניטור כוח אדם חזקים היא קריטית למזעור הנטל הביולוגי המיקרוביאלי בחדרי הייצור של הטיפול התאי ובמעבדות הבדיקה המתאימות, כדי להבטיח שהמתקנים פועלים במצב של שליטה. הבטחת בטיחות המוצר באמצעות אמצעי בקרת איכות, כגון בדיקות סטריליות, היא דרישה רגולטורית הן עבור מניפולציה מינימלית (סעיף 361) והן עבור יותר ממניפולציה מינימלית (סעיף 351) עבור תאים אנושיים, רקמות ומוצרים מבוססי תאים ורקמות (HCT/Ps). בסרטון זה, אנו מספקים מדריך מדורג כיצד לפתח ולשלב את שיטות העבודה האספטיות הטובות ביותר לפעולה בסביבת חדר נקי, כולל חלוק, ניקוי, בימוי חומרים, ניטור סביבתי, ניטור תהליכים ובדיקת סטריליות מוצרים באמצעות חיסון ישיר, המסופק על ידי הפרמקופיאה של ארצות הברית (USP<71>) ושיטת בדיקת הסטריליות האלטרנטיבית של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH). פרוטוקול זה מיועד לשמש כמדריך עזר למפעלים הצפויים לעמוד בשיטות הקיימות של רקמות טובות (cGTP) ובשיטות הייצור הטובות הנוכחיות (cGMP).

Introduction

יישום תוכנית ניטור מיקרוביאלית חזקה באמצעות ניטור סביבתי (EM), ניטור תהליכים ובדיקות סטריליות של מוצרים הוא דרישה רגולטורית עבור שיטות קיימות של רקמות טובות (cGTP) ושיטות ייצור נאותות נוכחיות (cGMP) במעבדות לטיפול תאי¹. בנוסף, מנהל המזון והתרופות האמריקני (FDA) מצפה כי המעבדה המבצעת את בדיקות בקרת האיכות (QC) של המוצר צריכה גם להעסיק מתקנים ובקרות דומים לאלה המשמשים לפעולות מילוי אספטי².

פרוטוקול זה כולל ארבעה חלקים עיקריים: 1) פרקטיקות אספטיות, כולל הלבשת כוח אדם, ניקוי ובימוי חומרים; 2) EM, כולל תרביות אוויר ופני שטח בנות קיימא וניטור אוויר חלקיקים שאינו בר קיימא; 3) ניטור תהליכים, כולל צלחות שיקוע ודגימת קצות אצבעות בכפפות; ו-4) בדיקת סטריליות של מוצרים באמצעות הפרמקופיאה של ארצות הברית (USP) <71> שיטה³ או שיטת בדיקת סטריליות חלופית של NIH⁴. כאשר משתמשים בהם יחד, אמצעים אלה יכולים להיות שיטה יעילה להבטיח כי מתקן נשאר במצב של שליטה.

הטכניקות המתוארות כאן אינן חדשניות; עם זאת, הסטנדרטים הנוכחיים של רגולטורים וארגונים מקצועיים חסרים פירוט, מה שהוביל להיעדר ניטור מיקרוביאלי או יישום של פרקטיקות לא סטנדרטיות, במיוחד במרכזים אקדמיים שבהם ייצור באתר ובדיקות סטריליות מוצרים מתעוררים בקצב מהיר ^1,5,6 . פרוטוקול זה יכול לשמש כמדריך ליצירת תוכנית ניטור ובקרה מיקרוביאלית העומדת בדרישות רגולטוריות כאשר נעשה בה שימוש בשילוב עם אימות משתמש קצה והערכות סיכונים.

Protocol

1. פרקטיקות אספטיות

1. שמלת כוח אדם לחלל חדר נקי
   הערה: הליך זה מבוסס על גלימה ראשונית בחלל לא מסווג, ולאחר מכן כניסה לאזור ארגון התקינה הבינלאומי (ISO) 8 ולאחר מכן לאזור ISO7. הליך זה רלוונטי למעבדות המנסות להסב חלל קיים לפונקציה של חדר נקי. באופן אידיאלי, כל השמלות הראשוניות יתרחשו בחלל מסווג ISO8 (לא בחלל לא מסווג).
   1. הבטיחו שיער רפוי. שטפו ידיים, והחליפו לקרצוף (חולצות קרצוף עם שרוולים ארוכים ומכנסי קרצוף באורך מלא עדיפים). אספו והחליפו לנעליים נקיות עם כיסויי נעליים.
   2. יש לחטא את הידיים באמצעות חומר חיטוי ידיים על בסיס אלכוהול תחילה ולאחר מכן שוב בין כל אחד מהשלבים הבאים: לבישת כפפות לא סטריליות ולאחר מכן כיסוי זקן (לכל כמות של שיער פנים גלוי), אם רלוונטי. לבשו בופנט לא סטרילי, וכסו את האמות בשרוולים לא סטריליים אם לא נעשה שימוש בחולצות קרצוף עם שרוולים ארוכים.
   3. הסירו את כיסויי הנעליים, ודרכו על השטיחון הדביק מול דלת הכניסה ISO8 עם כל רגל לאחר הסרת כיסוי הנעל. ודאו שכף הרגל כולה יוצרת מגע עם המזרן הדביק לפני הכניסה. יש להשליך את כיסויי הנעל ולטהר את הכפפות ואת ידית הדלת באיזופרופיל אלכוהול סטרילי (sIPA) 70%. הזן את חדר הכניסה ISO8.
   4. אספו מכסה מנוע סטרילי, מסכת פנים סטרילית, סרבלים סטריליים, כיסויי מגפיים סטריליים ומשקפי בטיחות. יש לטהר את הכפפות עם 70% sIPA. הרכיבו משקפי בטיחות, והעלו את החומרים על משטח נקי, לפי שלב 1.5.
   5. לבשו זוג חדש של כיסויי נעליים לא סטריליים מעל נעלי החדר הנקי הייעודיות, וצעדו על המחצלת הדביקה שלפני המבואה המשנית. ודא שכל כף רגל יוצרת מגע עם המחצלת הדביקה. יש לטהר את הכפפות עם 70% sIPA. אספו את ציוד השמלות המבוימות, והיכנסו לחדר המבואה המשני ISO7, ונשארו בצד המלוכלך של קו התיחום.
   6. לבשו את מכסה המנוע הסטרילי ואת הכיסוי הסטרילי, נגעו רק בחלק הפנימי של חומר החלוק ודאגו שצוואר המכסה יהיה תחוב בתוך הכיסוי כדי ליצור אטימה שלמה. לבשו את כיסויי המגפיים הסטריליים המשניים. יש לטהר את הכפפות עם 70% sIPA בין כל שלב לבישה.
   7. יש לוודא שהחלוק נלבש כראוי, לטהר את הכפפות עם 70% sIPA ולהיכנס לחלל ISO7.
      הערה: בדוק מעת לעת את שלמות חומר השמלה. במקרה של פגיעה, צאו מיד מהחדר הנקי והתלבשו מחדש.
2. תרומה לארון בטיחות ביולוגי (BSC)
   1. שמלה לפי שלב 1.1 לעיל עם תרגולים נוספים אלה.
   2. אספו כפפות סטריליות ושרוולים סטריליים. נקו את ה-BSC לפי שלב 1.4, ושלבו את החומרים לפי שלב 1.5. יש לטהר את הכפפות עם 70% sIPA.
   3. יש ללבוש שרוולים סטריליים מעל הכיסוי, באמצעות לולאות אגודל אם קיימות. לבשו כפפות סטריליות מעל הכפפות הקיימות, וודאו ששרוול הכפפה משתרע על השרוול הסטרילי. יש לטהר את הכפפות עם 70% sIPA בין כל שלב. הזן את BSC.
      הערה: בדוק מעת לעת את שלמות חומר השמלה. במקרה של פגיעה, צאו מיד מהחדר הנקי והתלבשו מחדש.
3. דיכוי של חומרי השמלה
   1. צא מה- BSC, והסר בזהירות את זוג הכפפות העליון והשרוולים הסטריליים. יש לטהר את הכפפות הפנימיות עם 70% sIPA.
   2. היכנסו לחדר הכניסה המשני ולאחר מכן הראשי, והמתינו שהדלת תיסגר במלואה בין כל שלב. הסר את החומרים בסדר הבא: כיסויי מגפיים סטריליים חיצוניים, כיסוי, מכסה מנוע ומסכת פנים.
   3. צא מחדר הכניסה הראשי, והסר את החלוק הלא סטרילי.
      הערה: סדר ההסרה בחלל הלא מסווג אינו חשוב; עם זאת, כיסויי הנעליים הפנימיים שאינם סטריליים צריכים להישאר על נעלי החדר הנקי לאחסון בחללים לא מסווגים.
   4. יש לחטא את הידיים באמצעות חומר לחיטוי ידיים על בסיס אלכוהול, ולחזור לבגדי רחוב.
4. ניקוי משטחי החדרים הנקיים וה- BSC
   1. הרכיבו מגב ניקוי ידני, או השיגו מגבון נקי בעל סיבים נמוכים. אם משתמשים במגבון עם סיבים נמוכים, קפלו את המגבון לרבעים וסובבו בין כל משטח. יש להרוות את ראש המגב או המגבון בעל המוך הנמוך בחומר חיטוי מאושר.
   2. בעבודה מאחור לחזית (או מלמעלה למטה), נקו את ה-BSC באמצעות מגבונים חופפים בסדר הבא: גריל הדיפיוזר HEPA (החלק העליון של ה-BSC), הקיר האחורי של ה-BSC, שני הדפנות הצדדיות של ה-BSC, האבנט ומשטח העבודה. לבסוף, נגבו את האבנט של ה-BSC באמצעות 70% sIPA כדי להסיר שאריות של חומר חיטוי. עיינו באיור 1 לקבלת תבנית ניקוי טיפוסית של BSC.
5. הצבת חומרים וציוד בסביבות מסווגות
   1. לטהר (כלומר, שלב) את כל החומרים הדורשים העברה מאזור לא מסווג או מסווג נמוך יותר לאזור מסווג יותר (למשל, ממרחב ISO8 למרחב ISO7) כדי למזער את העברת החיידקים. העברת חומרים בין אזורים באותה רמת סיווג ISO אינה דורשת בימוי.
      הערה: אם החומרים עברו עיקור סופני ונמצאים במספר שקיות, הסר את השקית/השקית החיצונית והעבר את החומר לחלל המסווג; אין צורך לנגב את השקית/השקית הפנימית.
   2. השג מגבון בעל סיבים נמוכים, וקפל את המגבון לרבעים כדי לסובב לצד נקי כשהמגבון מתלכלך. יש להרוות את המגבון ב-70% sIPA או בחומר חיטוי מאושר.
   3. נגבו את החלק החיצוני של החומר/ציוד באמצעות מגבונים חופפים. ודא שכל אזורי הפריט מנוגבים, כולל החלק הפנימי של אטמי אריזה מתפרקים ופינות/כניסות על הציוד וחומרים מתכלים אחרים בעלי צורה לא סדירה. עבור ציוד על גלגלים, ודא שכל הגלגל ניגב במהלך תהליך ההיערכות (ייתכן שיהיה צורך להטות את הציוד בעדינות כדי לאפשר את סיבוב הגלגלים).

איור 1: דוגמה לתבנית ניקוי BSC. בעבודה מאחור לחזית (או מלמעלה למטה), נקו את ה-BSC באמצעות מגבונים חופפים בסדר הבא: גריל הדיפיוזר HEPA (החלק העליון של ה-BSC), הקיר האחורי של ה-BSC, שני הדפנות הצדדיות של ה-BSC, האבנט ומשטח העבודה. לבסוף, נגבו את האבנט של ה-BSC באמצעות 70% sIPA כדי להסיר שאריות של חומר חיטוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

2. ניטור סביבתי (EM)

1. דגימת משטח בת קיימא
   1. שלב את החומרים הדרושים לפגישת הדגימה לפי שלב 1.5, ואת החלוק לחלל המסווג לפי סעיף 1.
      הערה: יש לבצע את דיגום פני השטח לפני דיגום האוויר בכל מקום שצוין. אם אתם משתמשים במספר לוחות לדגימת משטח של אזור, אל תדגמו את אותו מיקום בדיוק. השתמש בלוחיות מגע כדי לדגום משטחים שטוחים רק כדי להבטיח מגע מלא וכדי למנוע נזק פוטנציאלי לאגר.
   2. אספו ותייגו אגר סויה טריפטי אחד עם צלחת לציטינאז וטווין (TSALT) ואגר דקסטרוז Sabouraud אחד עם לציטינאז וצלחת טווין (SABLT) עבור כל אתר דגימה. מחזיקים את תחתית הצלחת ביד אחת, מסירים את המכסה, נזהרים לא לגעת במשטח האגר המוגבה.
   3. געו באגר המוגבה במשטח הנדגם, וודאו שכל המשטח נמצא במגע, והפעילו לחץ חזק על הצלחת. השאירו את הצלחת במגע עם המשטח למשך 5 שניות לפחות.
   4. קריטי: אין להזיז את הצלחת לרוחב על פני השטח הנדגמים, מכיוון שהדבר עלול לפזר צמיחה פוטנציאלית על פני שטח הפנים, מה שמקשה על הרזולוציה של מושבות בודדות. אין להפעיל כוח מופרז על לוחית המגע במהלך הדגימה, מכיוון שמשטח האגר עלול להיסדק.
   5. החליפו את הכיסוי, נזהרים שלא לגעת במשטח האגר המוגבה. נעל את המכסה במקומו אם לוחית המגע כוללת מערכת נעילה. נקו את אזור הדגימה עם 70% sIPA כדי להסיר שאריות תווך מפני השטח. יש לארוז את הצלחות באופן רופף, ולדגור על התרביות כמתואר בטבלה 1. תמונה מייצגת המראה צמיחה של שלוש יחידות יוצרות מושבה (CFUs) עם שתי מורפולוגיות מושבה נפרדות על לוח דגימת משטח TSALT מודגמת באיור 2. איור 3 מראה זיהום של צלחת TSALT עם צמיחה בקצה הצלחת, המיוחסת לטכניקה אספטית לקויה במהלך איסוף הדגימות.
2. דגימת אוויר בת קיימא
   1. שלב את החומרים הדרושים לפגישת הדגימה לפי שלב 1.5, ואת החלוק לחלל המסווג לפי סעיף 1.
   2. אספו ותייגו צלחת אחת של אגר סויה טריפטי (TSA) וצלחת אחת של אגר דקסטרוז סאבורו (SAB) עבור כל אתר דגימה. הכינו את דוגם האוויר על ידי הסרה אספטית של ראש הדגימה על ידי אחיזה רק בקצה החיצוני כדי למנוע זיהום הראש.
   3. מחזיקים את ראש הדגימה ביד אחת, מניחים את המדיום במחזיק הצלחת על הדוגם. אם יש שיניים ארוכות יותר מהאחרות, הכניסו תחילה את התווך כנגד השיניים הארוכות יותר, ולאחר מכן דחפו את הצלחת מטה לתוך השיניים הנותרות כדי לאבטח את הצלחת.
   4. הסירו את מכסה הצלחת והניחו אותו על משטח נקי הרחק מהדרך עד לסיום הדגימה. יש להחליף ולאבטח את ראש הדגימה, תוך אחיזה רק בקצה החיצוני כדי למנוע זיהום הראש. חזור על שלבים 2.2.2-2.2.4 עבור המדיום הנותר אם אתה משתמש בדוגם אוויר רב-ראשי.
   5. מקם את דוגם האוויר במיקום הדגימה כאשר ראשי הדגימה פונים לכיוון השולט של תנועת זרימת האוויר. ודא שהפליטה מדוגם האוויר שאינו בר-קיימא (אם הדגימה בו זמנית) אינה מפריעה לדוגם הבר-קיימא. ודא שדוגם האוויר מוגדר להגדרות שאומתו, והתחל את מחזור הדגימה.
   6. לאחר סיום מחזור הדגימה, יש להסיר את ראש הדגימה מהדוגם על ידי אחיזה רק בקצה החיצוני כדי למנוע זיהום הראש. החזיקו את ראש הדגימה ביד אחת, והחליפו את מכסה צלחת האגר. מוציאים את הצלחת ממחזיק הצלחת. יש לארוז את הצלחות באופן רופף, ולדגור על התרביות כמתואר בטבלה 1.
   7. יש לחטא את ראש הדגימה ואת האזור סביב מחזיק הצלחת עם 70% sIPA. מאבטחים היטב את ראש הדגימה, ואוחזים רק בקצה החיצוני. חזור על שלב 2.2.6 ושלב 2.2.7 עבור המדיום הנותר אם אתה משתמש בדוגם אוויר רב-ראשי.
      הערה: איור 4 מראה תרבית דגימת אוויר פעילה של TSA עם צמיחה הנגרמת על-ידי ראש דגימה מזוהם. לעומת זאת, איור 5 מייצג תרבית דגימת אוויר פעילה של TSA ללא צמיחה. ניתן לראות כניסות פגיעת אוויר מראש הדגימה בתמונה.
3. דגימה שאינה בת קיימא
   1. בצע בדיקת אפס על מונה חלקיקי הלייזר לפני פעולות הדגימה עבור כל יום שימוש. חבר את הראש האיזוקינטי ליציאת הדגימה של מונה החלקיקים ישירות או מודבק לאורך צינורות לפי הצורך למיקום הדגימה.
   2. אם מיישמים אבובים, השתמשו באורך קצר, מכיוון שצינורות באורך >1 מ' עלולים לגרום לבעיות בספירת חלקיקים של ≥1 מיקרומטר ועלולים גם להוביל לכיפוף מיותר בצינור. ודא שמונה החלקיקים מוגדר להגדרות שאומתו. מומלץ לקבוע השהיה של כ-30 שניות כדי לאפשר יציאה מאזור הדגימה כדי למנוע הפרעה לזרימת האוויר במהלך הדגימה.
   3. מקם את הראש האיזוקינטי של מונה חלקיקי הלייזר במיקום הדגימה כאשר הראש האיזוקינטי פונה לכיוון השולט של תנועת זרימת האוויר. ודא שהפליטה מדוגם האוויר הבר-קיימא (אם הדגימה בו זמנית) אינה מפריעה לדוגם שאינו בר-קיימא. באזורים שבהם זרימת האוויר אינה חד-כיוונית או שתבנית זרימת האוויר אינה ידועה, ודאו שהראש האיזוקינטי פונה אנכית כלפי מעלה.
      הערה: אם נעשה אירוסוליזציה של חומר חיטוי סיבובי או 70% sIPA ליד דוגם האוויר, יש להמתין לפחות 5 דקות לפני תחילת מחזור הדגימה.
   4. התחל את מחזור הדגימה, וצא באיטיות מאזור הדגימה כדי למנוע הפרעה לזרימת האוויר.
      קריטי: אין לרסס נוזלים בקרבת דוגם האוויר במהלך מחזור הדגימה, מכיוון שהדבר יגרום לספירות גבוהות שאינן בנות קיימא.
   5. לאחר השלמת הדגימה, אחזר את מונה חלקיקי הלייזר. רשום את ספירת החלקיקים הממוצעת עבור 0.5 מיקרומטר. מתקנים מסוימים עשויים גם לעקוב אחר ומגמה של 5.0 מיקרומטר.
   6. חזור על השלבים 2.3.3-2.3.6 עבור מיקום הדגימה הבא. אם אתם עוברים בין חדרים או BSC, נגבו את החלק החיצוני של דוגם החלקיקים שאינו בר-קיימא עם 70% sIPA או חומר חיטוי מאושר. הימנע מקבל חיטוי בתוך הראש איזוקינטי, כמו זה יכול להוביל ספירת חלקיקים לא מדויקת.

קטגוריה	מדיה	תנאי תרבות		התבוננות תרבותית			תוצאות
ניטור סביבתי	TSA (אוויר בר קיימא)	30 °C-35 °C, אוויר, לפחות 3 ימים		סוף הדגירה			קבוצת אבטחת האיכות של כל מתקן צריכה לקבוע מגבלות התראה ופעולה עבור כל סוג דגימה ומיקום. ניתן להנחות מגבלות פעולה עבור דגימות בנות קיימא המבוססות על סיווג ISO באמצעות PIC/S 009-16 (נספחים) 18 ו- ISO-14644-1 7. מגבלות פעולה עבור דגימות אוויר שאינן בנות קיימא מוגדרות בדרך כלל לאחוז ממגבלת ISO (למשל, 99%). מגבלות התראה עבור דגימות בנות קיימא מוגדרות בדרך כלל לאחוז ממגבלת הפעולה או מגבלת ISO (לדוגמה, 95%). עיין ב- PDA TR-13 וב- USP<1116> לקבלת פרטים נוספים אודות קביעת רמות התראה ופעולה ואימות תנאי תרבות נבחרים 8,9.
	SAB (אוויר בר קיימא)	20 °C-25 °C, אוויר, לפחות 7 ימים
	TSALT (משטח בר קיימא)	30 °C-35 °C, אוויר, לפחות 3 ימים					תמונות מייצגות של לוחות EM מוצגות באיור 2, איור 3, איור 4 ואיור 5.
	SABLT (משטח בר קיימא)	20 °C-25 °C, אוויר, לפחות 7 ימים
ניטור תהליכים	TSA (צלחת שיקוע)	30 °C-35 °C, אוויר, לפחות 3 ימים					למידע בלבד. מספק מידע שימושי במקרה של חקירת OOS בתגובה לבדיקת סטריליות מוצר כושלת.
	SAB (צלחת שיקוע)	20 °C-25 °C, אוויר, לפחות 7 ימים					ראו איור 6 דוגמה ללוח שיקוע חיובי.
דגימת קצות אצבעות בכפפה	צאלט	30 °C-35 °C, אוויר, לפחות 48 שעות ימים ואחריו 20 °C (75 °F-25 °F) לפחות 5 ימים 19.					קריטריוני הקבילות עבור GFS הם <1 CFU/plate (כלומר, ללא גידול) לפי PIC/S 009-16 (נספחים) 18. קריטריוני הקבילות עשויים להשתנות על פי שיקול דעתו של מתקן QA.
בדיקת סטריליות המוצר	TSB (USP<71>)	20 °C-25 °C, אוויר, לפחות 14 ימים		מעת לעת לאורך תקופת הדגירה (ימים 3, 5, 7 ו-14)			אין צמיחה.
	FTM (USP<71>)	30 °C-35 °C, אוויר, לפחות 14 ימים
	iFA+ (שיטת NIH)	30 °C-35 °C, אוויר, לפחות 14 ימים		ניטור אוטומטי על ידי מכשיר BacT/ALERT Dual-T. מומלץ מאוד לבדוק ויזואלית כל בקבוק בסוף הדגירה לכדורי עובש.			ראו איור 8 דוגמה לכדורי עובש גלויים שלא זוהו אוטומטית על-ידי BacT/ALERT.
	iFN+ (שיטת NIH)
	SAB (שיטת NIH)	20°C-25°C למשך 14 ימים לפחות		מעת לעת לאורך תקופת הדגירה (ימים 3, 5, 7 ו-14)

טבלה 1: סיכום תנאי התרבית המומלצים והתוצאות הצפויות. תנאי התרבות המתוארים כאן הם המלצות המבוססות על תוכנית מתוקפת המשמשת ב- NIH. כל משתמש קצה נדרש לאמת את תוכנית בדיקות המיקרוביולוגיה שלו. אסטרטגיות הבקרה והבדיקות המיקרוביאליות עשויות להשתנות בין המכונים בהתאם למשתנים, כולל תכנון המתקן, צמחיית המתקנים וסיווג סיכוני המוצר.

איור 2: צמיחה על צלחת המלח. לוח דגימת פני השטח של TSALT מראה שלושה CFUs של שתי מורפולוגיות מושבה נפרדות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: זיהום של צלחת TSALT במהלך האיסוף. תרבית פני השטח של TSALT מראה מושבה בודדת בקצה הצלחת, המעידה על טיפול אספטי לקוי בתהליך הדגימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: תרבית שהתקבלה באמצעות ראש דגימת אוויר מזוהם. דוגמה לתרבית דגימת אוויר פעילה של TSA המציגה >100 יחידות יוצרות מושבה (CFU) של מורפולוגיות מעורבות. דפוס הגידול מצביע על זיהום של ראש הדגימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: אין גידול בלוח אוויר פעיל של TSA. פלטת אוויר פעילה של TSA הממחישה שאין צמיחה לאחר הדגירה. ניתן לראות כניסות מראש דוגם האוויר הפעיל בתמונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

3. ניטור תהליכים

1. פלטות שיקוע (ניטור אוויר פסיבי)
   1. הניחו לוחות TSA ו-SAB מסומנים בסמוך לאזור העבודה, אך באזור שלא יפריע לבדיקה. תעדו את שעת תחילת הדגימה, ופתחו את שתי הלוחות, תוך הנחת המכסים על משטח נקי ב-BSC הרחק מאזור העבודה.
   2. לוחות השיקוע עשויים להיות פתוחים למשך זמן מקסימלי של 4 שעות כדי למנוע מהאגר להתייבש. סגור את מכסי הצלחות בסוף העיבוד. יש לארוז את הצלחות באופן רופף, ולדגור על התרביות כמתואר בטבלה 1. איור 6 מראה מזהם מושבה יחיד על לוח שיקוע אוויר TSA.
2. דגימת קצות אצבעות בכפפה (GFS)
   1. השג שתי צלחות TSALT מסומנות. הסירו את המכסה של צלחת אחת, והניחו אותה על משטח עבודה נקי הרחק מאזור הדגימה.
   2. גלגלו בעדינות את הכרית של כל אצבע ואגודל של יד אחת על פני הצלחת (איור 7). דגמו את שטח הפנים הגדול ביותר של כל אצבע/אגודל ולא את הקצה. השתמש בכוח מספיק כדי ליצור שקעים קלים על האגר מבלי לסדוק את משטח האגר.
   3. הניחו את המכסה בחזרה על הצלחת, וחזרו על שלב 3.2.2 עבור היד השנייה. יש לחטא את הידיים עם 70% sIPA בסיום הדגימה. יש לארוז את הצלחות באופן רופף, ולדגור על התרביות כמתואר בטבלה 1.

איור 6: צמיחה על לוח שיקוע אוויר TSA. לוח שיקוע אוויר TSA הממחיש מושבה אחת של מזהם שתורבת במהלך ניטור פסיבי של תהליך האוויר ב- BSC. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 7: דגימת קצות אצבעות בכפפות. השיטה הנכונה לקבלת דגימות קצה אצבע בכפפה באמצעות שטח הפנים (או הפד) הגדול ביותר של כל אצבע/אגודל מוצגת משמאל. התהליך השגוי שבו נדגם רק קצה האצבע מוצג מימין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

4. בדיקת סטריליות על ידי חיסון ישיר של המוצר

1. חיסון ישיר לאחר USP<71>
   1. השג בקבוק אחד מסומן של מרק סויה טריפטי (TSB) ובקבוק אחד עם תווית של תיוגליקולט נוזלי בינוני (FTM) עבור כל מאמר בדיקה שהוגש. עבור מפגש הבדיקה, השג TSALT אחד ו- SABLT אחד לדגימת משטח בת קיימא, צלחת TSA אחת וצלחת SAB אחת לשיקוע צלחות, ושתי לוחות TSALT עבור GFS.
   2. שמלה לעבודה בתוך BSC לפי שלב 1.2. נקה את BSC לפי שלב 1.4. שלב את החומרים לתוך BSC לפי שלב 1.5. בצע דגימת מגע של אזור העבודה הקריטי לפי שלב 2.1, וניגב את המשטח עם 70% sIPA לאחר הדגימה. הכינו את לוחות השיקוע TSA ו-SAB בסמוך לאזור העבודה לפי שלב 3.1.
   3. השג את מאמר הבדיקה ואת בקבוקי TSB ו- FTM המשויכים. אם לבקבוקי TSB ו-FTM יש מחיצה, הסירו את פקקי המגן מכל בקבוק, ונגבו את המחיצה במגבון אלכוהול סטרילי. אם לבקבוקי TSB ו-FTM יש ראש בורג, שחררו את הפקק מהבקבוקים (אך אל תסירו את הפקק).
   4. מערבול את מאמר הבדיקה כדי להבטיח השעיה הומוגנית. יש לחסן את הבקבוקים בנפח המאומת של מאמר הבדיקה (עד 10 מ"ל לבקבוק) באמצעות מזרק סטרילי ומחט היפודרמית (לפקקי מחיצה) או פיפטור (לפקקי בורג).
   5. לאחר החיסון יש לנגב את המחיצה במגבון אלכוהול סטרילי, ולהכניס יחידת אוורור סטרילית כדי לאפשר החלפת אוויר במהלך הדגירה. עבור בקבוקים עם הברגה, סגרו את הבקבוק אך השאירו את הפקק 1/4 עד 1/2 סיבוב רופף כדי לאפשר החלפת אוויר במהלך הדגירה. חזור על שלבים 4.1.3-4.1.5 עבור כל מאמר בדיקה שייבדק במהלך הפעלה זו.
   6. סגור באופן אספטי את לוחות השיקוע TSA ו- SAB, ותעד את שעת סיום הדגימה. בצע GFS לפי שלב 3.2, ניגוב הכפפות עם 70% sIPA לאחר הדגימה. יש לארוז את הצלחות באופן רופף, ולדגור על התרביות כמתואר בטבלה 1.
   7. העבר את כל חומרי הבדיקה מתוך BSC, ונקה את BSC לפי שלב 1.4.
2. חיסון ישיר בשיטת בדיקת סטריליות אלטרנטיבית של NIH
   1. השג צלחת אחת עם תווית i FA+, צלחת אחת עם תווית iFN+ וצלחת SAB אחת עבור כל מאמר בדיקה. עבור מפגש הבדיקה, השג TSALT אחד ו- SABLT אחד לדגימת משטח בת קיימא, צלחת TSA אחת וצלחת SAB אחת לשיקוע צלחות, ושתי לוחות TSALT עבור GFS.
   2. שמלה לעבודה בתוך BSC לפי שלב 1.2. נקה את BSC לפי שלב 1.4. שלב את החומרים לתוך BSC לפי שלב 1.5. בצע דגימת מגע של אזור העבודה הקריטי לפי שלב 2.1, וניגב את המשטח עם 70% sIPA לאחר הדגימה. הכינו את לוחות השיקוע TSA ו-SAB בסמוך לאזור העבודה לפי שלב 3.1.
   3. השג את מאמר הבדיקה ואת צלחת i FA+ , iFN+ ו- SAB המשויכים. הסירו את פקקי ההגנה מבקבוקי i FA+ ו-iFN+ ונגבו את המחיצה במגבון אלכוהול סטרילי.
   4. מערבול את מאמר הבדיקה כדי להבטיח השעיה הומוגנית. יש לחסן את הבקבוקים בנפח המאומת של מאמר הבדיקה (עד 10 מ"ל לבקבוק) באמצעות מזרק סטרילי ומחט היפודרמית. נגבו את המחיצה במגבון אלכוהול סטרילי לאחר החיסון. יש לדגור על הבקבוקים במכשיר BacT/ALERT Dual-T כמתואר בטבלה 1.
   5. באמצעות פיפטור, לחסן את צלחת SAB עם כמות מאומתת של מאמר הבדיקה (לא יותר מ 500 μL / צלחת), ופס לבידוד באמצעות לולאה סטרילית. תן לעמוד במשך 10 דקות כדי להבטיח שהדגימה לא תרוץ על מכסה הצלחת כאשר היא הפוכה לדגירה. הכניסו כל לוחית SAB מחוסנת עם פריט הבדיקה לשקית ניילון, קשרו באופן רופף ודגרו כמתואר בטבלה 1.
   6. סגור באופן אספטי את לוחות השיקוע TSA ו- SAB, ותעד את שעת סיום הדגימה. בצע GFS כמתואר בשלב 3.2, ניגוב הכפפות עם 70% sIPA לאחר הדגימה. יש לארוז את הצלחות באופן רופף, ולדגור על התרביות כמתואר בטבלה 1. בדיקה חזותית של בקבוקי BacT/ALERT בסוף תקופת הדגירה חיונית לאיתור כדורי עובש שייתכן שלא זוהו על-ידי המכשיר (איור 8).
   7. העבר את כל חומרי הבדיקה מתוך BSC, ונקה את BSC לפי שלב 1.4.

איור 8: צמיחת עובש שלא זוהה על-ידי BacT/ALERT. דוגמה לכדורי עובש, גלויים לעין בלתי, שלא זוהו אוטומטית על ידי מערכת BacT/ALERT. בהתבסס על ממצאים אלה, אנו ממליצים על בדיקה ויזואלית סופנית של כל בקבוקי BacT/ALERT והוספת צלחת SAB לתרבית פטרייתית באמצעות שיטת בדיקת הסטריליות החלופית של NIH. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תוצאות

התוצאות הצפויות מתוארות בטבלה 1. יש לבדוק את נתוני EM ולעקוב אחריהם עם חקירה מתאימה ותגובה לפעולה, התראה או טיולי הגבלת ISO. אם מתרחש טיול עבור חלקיקים שאינם בני קיימא, יש להמשיך לפי ISO 14644-Annex A, sec A.5.5⁷. אם ניתן לייחס את הטיול להתרחשות חריגה הניתנת לזיהוי מיידי, יש לתעד את תו?...

Discussion

ישנם מספר תחומים קריטיים בפרוטוקול זה, כולל תחזוקה של טכניקה אספטית וזרימת אוויר חד-כיוונית בתוך חדרים נקיים ו- BSC. שיטות עבודה מומלצות כוללות תנועה איטית ומכוונת כדי למזער מערבולות. מניפולציות אספטיות צריכות להתבצע מצד המוצר, לא מלמעלה. מומלץ לבצע עיבוד מערכת סגורה ושימוש בחומרי גלם מעוק?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
20-25°C Incubator			Lab preference
30-35°C Incubator			Lab preference
Alcohol-based hand sanitizer			Lab preference
BacT/ALERT Dual-T instrument	BioMerieux Industry
Beard cover			Lab preference
Biosafety cabinet (BSC)			Lab preference
Cleanroom shoes			Lab preference
Fluidthioglycollate medium (FTM)	Hardy Diagnostics	U84	USP
Handheld cleaning mop	Contec	2665LF
Hypodermic needle			Lab preference
iFA+ BacT/ALERT bottle	Biomerieux	412990
iFN+ BacT/ALERT bottle	Biomerieux	412991
Isokinetic head			Lab preference
Laser particle counter	TSI Incorporated	9500-01
LpH III	Steris	1S16CX
Mirror			Lab preference
Non-sterile bouffant			Lab preference
Non-sterile gloves			Lab preference
Non-sterile shoe covers			Lab preference
Non-sterile sleeve covers			Lab preference
Parafilm			Lab preference
Peridox RTU	Contec	CR85335IR
Plastic bag			Lab preference
Sabouraud Dextrose Agar with Lecithinase and Tween (SABLT)	Hardy Diagnostics	P595	USP, irradiated
Sabouraurd Dextrose Agar (SAB)	Hardy Diagnostics	W565	USP, irradiated
Safety glasses			Lab preference
Scrubs (top and bottom)			Lab preference
Spor-Klenx RTU	Steris	6525M2
Sterile 70% isopropyl alcohol (IPA)	Decon CiDehol	8316
Sterile alcohol wipe			Lab preference
Sterile boot covers	Kimberly Clark		Cat# varies based on size
Sterile coveralls	Kimberly Clark		Cat# varies based on size
Sterile face mask			Lab preference
Sterile gloves			Lab preference
Sterile hood	Kimberly Clark		Cat# varies based on size
Sterile low-lint wipes	Texwipe	TX3210
Sterile mop cleaning pads	Contec	MEQT0002SZ
Sterile sleeve covers	Kimberly Clark	36077
Sterile spreading rod	Fisher Scientific	14665231
Sterile syringe			Lab preference
Tacky mats			Lab preference
Tryptic Soy Agar (TSA)	Hardy Diagnostics	W570R	USP, irradiated
Tryptic Soy Agar with Lecithinase and Tween (TSALT)	Hardy Diagnostics	P520R	USP, irradiated
Tryptic Soy Broth (TSB)	Hardy Diagnostics	U46	USP
Tubing			Lab preference
Vesphene III	Steris	1S15CX
Viable air sampler	Hardy Diagnostics	BAS22K
Vortex			Lab preference