Los autores desean agradecer a los miembros del personal del Fondo para la Universidad Deakin de pez cebra para proporcionar una excelente atención cría en curso. YG es apoyado por una beca de investigación postdoctoral Alfred Deakin y una Beca de Investigación Central de la Universidad de Deakin. SLM es apoyado por una beca de Desarrollo Profesional NHMRC. ACW es apoyado por una beca NHMRC Habilitación. Todos los autores son apoyadas por el Centro de Investigación de Investigación Molecular y Medicina Estratégica en la Universidad de Deakin.

Parte 1: Tratamiento químico de embriones de pez cebra <ol><li> Recoger embriones de pez cebra después de la fertilización. Se incuba a 28,5 º C en medio E3 en 100 × 15 mm placas de Petri Nota:. Para la hibridación in situ o de aceite-Red-O tinción, 1-fenil-2-tiourea (PTU) a una concentración final de 0,2 mM a inhibir la formación de pigmento, 1 pero no es necesaria para el análisis Seahorse. </li><li> Para los estudios farmacológicos, añadir la química necesaria a una concentración final apropiada para el desarrollo de embriones de pez cebra en alrededor de 26 horas después de la fertilización (hpf) con un adecuado vehículo de sólo control Nota:. Sensibles a la luz inhibidores farmacológicos, los embriones se puede permitir que se desarrollan en la oscuridad antes del análisis. </li></ol> Parte 2: Perfil metabólico en directo con el Seahorse XF 24 Analyser <ol><li> Antes de cada ejecución, el Seahorse XF 24 Analyser cartucho que alberga la 2 O y H <shasta&gt; + fluoróforos se calibra a través de un proceso automatizado realizado por el analizador. </li><li> Preparación de la placa de 24-así XF islote 24. La secuencia experimental se emplea el siguiente: <ol><li> Dado que el consumo de oxígeno es sensible a las fluctuaciones de temperatura, cuatro pozos se utilizan para controlar las fluctuaciones de temperatura posibles en toda la placa. Estos pozos no contienen embriones, pero se llenan con 700 l de medio de E3 (Figura 2A). </li><li> Los otros 20 pozos (véase el punto 2.2) se llenan con 700 l de medio E3 y un embrión de cada uno (Figura 2B). </li><li> Para cada experimento, 10 embriones se trataron con vehículo solo (control) y 10 tratados con inhibidor químico (tratada). Embriones de control y tratados se alternan (por ejemplo, el pocillo A2: embrión de control; así A3: embrión tratado: A4 bien: embrión de control; así embrión tratado A5, etc). </li><li> Una captura de pantalla de los islotes, se añade en la parte superior de. cada pocillo para asegurar que la muestra permanece en la cámara de medición durante todo el ensayo (Figura 2B) Nota: tratadas químicamente embriones permanecen con su solución química original durante todo el procedimiento, sin necesidad de lavar el producto químico antes de ejecutar el analizador Seahorse programa. </li><li> Una vez terminado, la placa se carga en el analizador de Seahorse y el ensayo se inicia. </li></ol></li><li> Análisis de muestras. Dos ensayos diferentes se realizan rutinariamente. <ol><li> Basal respiración / Máximo respiración programa (duración aprox. 90 min). Las alteraciones en la respiración basal apuntalar la disfunción metabólica, mientras que la respiración máxima es una medida de la capacidad total de producción de energía y alteraciones en este parámetro asociado con un número de estados patológicos y fisiológicos tanto. La capacidad respiratoria de repuesto, o la capacidad de sistema para aumentar aún más la producción de ATP, también se calculade esta prueba por la sustracción de basal de la respiración máxima. Tres repeticiones de cada mezcla (2 min) / WAIT (1 min) / medición (2 min) ciclo se realiza para establecer primera respiración basal. Al final del tercer ciclo, una concentración final de 2,5 M de FCCP (mitocondrial protonophore / desacoplador) se añadió a cada pocillo que permite la medición de respiración máxima. El ciclo de medición se repite 5 a 8 veces (Figura 3). </li><li> ATP facturación / Protón fuga programa (duración aprox. 60 min). La respiración debido a la rotación ATP representa la principal función de las mitocondrias en la forma de producción de ATP, mientras que la respiración debido a la fuga de protones, o respiración desacoplada, está inextricablemente vinculado con otros parámetros de la función mitocondrial, incluyendo la respiración basal y la formación de especies reactivas del oxígeno. Respiración debido a la rotación ATP está representada por la diferencia en la respiración después de la adición de oligomicina mu M 25 (un inhibidor de unaSintasa TP) en comparación con la respiración basal. Respiración no acoplado, o respiración debido a fugas de protones, se determina calculando la diferencia entre oligomicina mediada por la respiración y la respiración después de la adición de rotenona mu M 25 (un complejo inhibidor I). Ciclos de medición se repiten 8 veces después de la adición de cada inhibidor mitocondrial. </li></ol></li></ol> Al final de las carreras, los valores medios de control 10 y 10 embriones tratadas químicamente se calculan. Parte 3: Oil-Red-O tinción <ol><li> Los embriones en 50 hpf se dechorionated utilizando unas pinzas finas y se fijaron en PFA al 4% durante la noche a 4 ° C. </li><li> Oil-Red-O tinción se lleva a cabo, como se ha descrito anteriormente 2 (ver Figura 4). </li></ol>

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	<li>N&#252;sslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish. , (2002).</li><li>Schlombs, K., Wagner, T., Scheel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-1+protease+is+required+for+cartilage+development+in+zebrafish.">Site-1 protease is required for cartilage development in zebrafish.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 14024-14029 (2003).</li><li>Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+power+of+the+zebrafish+for+disease+analysis.">The power of the zebrafish for disease analysis.</a> Hum. Mol. Genet. 18, R107-R112 (2009).</li><li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+'knockdown'+in+zebrafish.">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).</li><li>Stackley, K. D., Beeson, C. C., Rahn, J. J., Chan, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profiling+of+zebrafish+embryonic+development.">Bioenergetic profiling of zebrafish embryonic development.</a> Plos One. 6, e25652 (2011).</li><li>McGee, S. L., Sadli, N., Morrison, S., Swinton, C., Suphioglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DHA+protects+against+zinc+mediated+alterations+in+neuronal+cellular+bioenergetics.">DHA protects against zinc mediated alterations in neuronal cellular bioenergetics.</a> Cell Physiol. Biochem. 28, 157-162 (2011).</li><li>Sivitz, W. I., Yorek, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+diabetes:+from+molecular+mechanisms+to+functional+significance+and+therapeutic+opportunities.">Mitochondrial dysfunction in diabetes: from molecular mechanisms to functional significance and therapeutic opportunities.</a> Antioxid. Redox Signal. 12, 537-577 (2010).</li><li>Bournat, J. C., Brown, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+obesity.">Mitochondrial dysfunction in obesity.</a> Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes Obes. 17, 446-452 (2010).</li><li>Ghafourifar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+multiple+sclerosis.">Mitochondria in multiple sclerosis.</a> Front Biosci. 13, 3116-3126 (2008).</li><li>Winklhofer, K. F., Haass, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson's+disease.">Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1802, 29-44 (2010).</li><li>Maruszak, A., Zekanowski, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+Alzheimer's+disease.">Mitochondrial dysfunction and Alzheimer's disease.</a> Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 35, 320-330 (2011).</li><li>de Moura, M. B., dos Santos, L. S., S, L., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+neurodegenerative+diseases+and+cancer.">Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and cancer.</a> Environ. Mol. Mutagen. 51, 391-405 (2010).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El pez cebra es un modelo genético bien establecido para tanto hacia adelante (ENU mutagénesis) y reversa (Tilling, dedo de zinc nucleasa específica knock-out, desmontables morfolino) enfoques genéticos 3,4, mientras que la función de genes en embriones de pez cebra también puede ser fácilmente bloqueado o activado usando compuestos selectivos farmacológicos específicos para los productos codificados. Debido a su desarrollo externo y pequeño tamaño, embriones de pez cebra son particularmente adecuados para el análisis del metabolismo. Sin embargo, robusta medición de perfil metabólico y la función mitocondrial in vivo en embriones de pez cebra no se ha conseguido, con sólo una descripción preliminar reportado 5. Análisis Seahorse fue diseñado originalmente para los estudios metabólicos basados ​​en células y se ha demostrado que dan resultados precisos y fiables 6. La aplicación de esta nueva metodología a los embriones de pez cebra es significativo, y es probable que aumentar el uso más amplio de este modelo para estudios metabólicos. En este estudio, hemos demostrado la medición de un rango de parámetros de respiración en embriones de pez cebra utilizando el Analizador de Seahorse, incluyendo la respiración basal, la respiración máxima, la capacidad respiratoria de recambio, el recambio de ATP y las fugas de protones. También proporcionamos un ejemplo de cómo dichas mediciones se pueden correlacionar con otros parámetros fisiológicos, en este caso la acumulación de lípidos, y de la utilización de inhibidores farmacológicos en este sistema de ensayo. En combinación con el uso de embriones genéticamente alterados, lo que proporciona una potente plataforma experimental para la comprensión de los factores que influyen en el metabolismo. Hay una gran variedad de aplicaciones para esta nueva metodología, con la disfunción mitocondrial está implicada en muchas enfermedades humanas, tales como diabetes mellitus 7, 8 obesidad, esclerosis múltiple 9, enfermedades de Parkinson 10, enfermedad de Alzheimer 11 y algún tipo de cáncer 12. Es importante destacar que, our trabajo se realiza in vivo, donde todas las influencias ambientales - tales como las citoquinas, etc relacionados con el desarrollo del crecimiento - están activas, proporcionando de este modo una vista fisiológicamente relevante en la respiración y el perfil metabólico in vivo. Como las pantallas de químicos también se realiza de manera rutinaria en el tipo salvaje y mutante embriones de pez cebra de fondo (Figura 1), los productos farmacéuticos novedosos que la respiración influencia, la función de las mitocondrias o el metabolismo pueda ser fácilmente identificados con el analizador Seahorse. Los resultados generados utilizando el analizador de Seahorse podría ser usado en conjunción con otros ensayos para proporcionar información adicional. Esto puede incluir el análisis fisiológico, tal como aceite rojo tinción, o análisis molecular, tal como la hibridación in situ para marcadores específicos de adipocitos como cebpα, PPAR, PPAR, FAS etc Quedan algunas limitaciones a esta metodología. A pesar de que nosotros y otros fueron capaces de utilizar oligomicina a mediure producción de ATP y fuga de protones en embriones jóvenes 5 (ver Figura 3), en embriones mayores de 60 hpf tratamiento oligomicina es ineficiente. Creemos que en los embriones más viejos oligomicina no se puede difundir con la misma facilidad que en los embriones más jóvenes poniendo los resultados imposibles de interpretar. Dado que los resultados oligomicina son obligatorios para la determinación de la respiración debido a la rotación ATP y la respiración no acoplado, actualmente estamos investigando concentraciones más altas de oligomicina para mayores embriones. Sin embargo, la antimicina A tratamientos siguen siendo eficacia más duradera, con otras mediciones, tales como la respiración basal, respiración máxima y la capacidad respiratoria de repuesto, se puede realizar en embriones de pez cebra mayores, hpf hasta 68 (no se muestra). Otra limitación en el uso de la configuración Seahorse Analyser actual es el espacio físico dentro de cada placa de captura de islote bien, de tal manera que sólo son adecuados para los embriones de pez cebra y larvas jóvenes. Por lo tanto, la realización de Metabolestudios de IC en obesidad inducida por dieta en peces adultos, por ejemplo, no es aún técnicamente factible. Sin embargo, este estudio puede llevar al desarrollo de placas especialmente diseñadas para los juveniles o adultos, ampliando así el alcance de los análisis posibles.

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> XF 24 analizador de flujo extracelular </td><td> Seahorse Bioscience </td><td> 100737-101 </td><td> Formato de 24 y </td></tr><tr><td> Islet microplaca de captura </td><td> Seahorse Bioscience </td><td> 101122-100 </td><td> Formato de 24 y </td></tr><tr><td> XF calibrante Solution </td><td> Seahorse Bioscience </td><td> 100840-000 </td><td></td></tr><tr><td> XF Medio de Ensayo </td><td> Seahorse Bioscience </td><td> 101022-100 </td><td></td></tr><tr><td> Oil-Red-O </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O0625 </td><td></td></tr><tr><td> 1-fenil-2-tiourea (PTU) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7629 </td><td>/ Zfbook/chapt10.html # wptohtml51 &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html # wptohtml51 </td></tr><tr><td> E3 (medio embrionario) </td><td> Self made </td><td> - </td><td> <a href="http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml16" target="_blank">http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html # wptohtml16</a> </td></tr><tr><td> 100x15 mm placas de Petri </td><td> Halcón </td><td> 35-1029 </td><td></td></tr><tr><td> FCCP </td><td> Sigma </td><td> C2920 </td><td></td></tr><tr><td> Oligomicina </td><td> Sigma </td><td> 75351 </td><td></td></tr><tr><td> Antimicina A </td><td> Sigma </td><td> A8674 </td><td></td></tr></tbody></table>

metabolic profile analysis of zebrafish embryos

Una meta que crece en el campo del metabolismo es determinar el impacto de la genética en diferentes aspectos de la función mitocondrial. La comprensión de estas relaciones ayudará a entender la etiología subyacente para una serie de enfermedades relacionadas con la disfunción mitocondrial, tales como la diabetes y la obesidad. Los recientes avances en la instrumentación, ha permitido a la monitorización de parámetros distintos de la función mitocondrial en líneas celulares o explantes de tejido. Aquí presentamos un método para un análisis rápido y sensible de parámetros de la función mitocondrial en vivo durante el desarrollo embrionario del pez cebra mediante el Seahorse biociencia XF 24 analizador de flujo extracelular. Este protocolo utiliza la captura Islet microplacas en un único embrión se coloca en cada pocillo, permitiendo la medición de la bioenergética, incluyendo: (i) la respiración basal, (ii) la respiración mitocondrial basal (iii) la respiración mitocondrial debido a la rotación de ATP; (iv) mitocondrial respiración desacoplada o proton fuga y (iv) de respiración máxima. Al utilizar este enfoque de embriones de pez cebra parámetros de respiración pueden ser comparados entre el tipo salvaje y embriones genéticamente alterados (mutante del gen sobre-expresión de genes o caída) o aquellos manipulados farmacológicamente. Se prevé que la difusión de este protocolo proporcionará a los investigadores con nuevas herramientas para analizar la base genética de los trastornos metabólicos in vivo en este modelo animal vertebrado pertinente.

<html> Estamos interesados ​​en entender el papel que los genes específicos en el metabolismo, en particular la tasa de respiración y el metabolismo lipídico. Por lo tanto, se trataron embriones de pez cebra de tipo silvestre de 26 en adelante HPF con un inhibidor farmacológico específico de la enzima codificada por uno de estos genes. En 50 hpf, medio del vehículo y los embriones tratados con inhibidores de la fueron analizados utilizando el Seahorse para la función mitocondrial, mientras que la mitad restante se fijaron en PFA al 4% durante la noche a 4 ° C y posteriormente se tiñeron para la deposición de lípidos con Oil-Red-O. El tratamiento con el inhibidor de la enzima específica dirigida a ~ 2 veces mayor en la respiración basal (Figura 4A), lo que se asoció con un aumento en la deposición de lípidos especialmente en el telencéfalo y debajo de la vesícula ótica (Figura 4B, C). pload/4300/4300fig1highres.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Representación esquemática del tratamiento químico de los embriones de pez cebra. Wildtype, genéticamente manipulados o tratados farmacológicamente embriones de pez cebra son de fondo. <img src="/files/ftp_upload/4300/4300fig2.jpg" alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4300/4300fig2highres.jpg"/> Figura 2. XF24 placa islote de configurar. (A) Cuatro pozos contienen medio embrionario sólo como control de la temperatura (marcado con una X) y los otros contienen un embrión / pocillo. (B) Primer plano de un bien (C6) que muestra un embrión de 50 hpf tipo salvaje tratados con vehículo (DMSO) cubierta por una pantalla de captura de islote (punta de flecha). <img src="/files/ftp_upload/4300/4300fig3.jpg" alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4300/4300fig3highres.jpg"/> Figura 3. Respiratparámetros de iones de tipo salvaje embriones de pez cebra 50 HPF. (A) Para cada medición, la media de los 20 embriones individuales se presenta. Respiración basal (media: 299,7; SD: 75,7; SEM: 16,9), la respiración máxima (media: 387,4; SD: 93,3; SEM: 20,9), la capacidad respiratoria de repuesto (media: 87,7; DE: 72,0; SEM: 16,1). (B) Para cada medición, la media de los resultados individuales 20 se presenta. Respiración basal mitocondrial; respiración mitocondrial debido a la rotación ATP; respiración mitocondrial desacoplada y la respiración no mitocondrial. Mt: mitocondrial; SRC: la capacidad respiratoria de repuesto; SD: desviación estándar, SEM: error estándar de la media. Los resultados se presentan en pmol de O 2 consumido / min / embrión. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4300/4300fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . <img src="/files/ftp_upload/4300/4300fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Reprelos resultados representativos de la exposición química en la respiración basal y la deposición de lípidos. (A, B) 50 hpf embriones se tiñeron con Oil-Red O en vista lateral. El embrión se incubó con el inhibidor selectivo (B) muestra más de tinción Oil-Red-O en el telencéfalo (punta de flecha) y por debajo de la vesícula ótica (flecha) en comparación con un embrión de control tratado con vehículo. (C) respiración basal muestra un ~ 2 veces mayor en los embriones tratados químicamente (n = 10 embriones por grupo). Los resultados se presentan en pmol de O 2 / min / embrión.

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Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

Pez cebra representan un modelo vertebrado poderosa que ha sido infrautilizado para estudios metabólicos. Aquí se describe una forma rápida para medir la<em&gt; In vivo</em&gt; Metabólico perfil de pez cebra en desarrollo que permite la comparación de diferentes parámetros de la función mitocondrial entre genética o farmacológicamente embriones manipulados, aumentando así la aplicabilidad de este organismo.

Análisis del perfil metabólico de embriones de pez cebra

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

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Research

JoVE Journal

Biology

19.8K vistas.  School of Medicine, Deakin University. Pez cebra representan un modelo vertebrado poderosa que ha sido infrautilizado para estudios metabólicos. Aquí se describe una forma rápida para medir la In vivo Metabólico perfil de pez cebra en desarrollo que permite la comparación de diferentes parámetros de la función mitocondrial entre genética o farmacológicamente embriones manipulados, aumentando así la aplicabilidad de este organismo.

Video: Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinyección de ARNm y oligonucleótidos antisentido Morpholino en embriones de pez cebra.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Investigación

Biología

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinyección de embriones de pez cebra para analizar la función génica

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

La generación de embriones quiméricos de pez cebra mediante un trasplante

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

De dos fotones basado en fotoactivación en vivo embriones de pez cebra

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase or the elongation phase by a variety of cellular stresses such as amino acid starvation or growth factor withdrawal. Alternatively, translation of individual mRNAs can be regulated by mRNA localization or the presence of cognate microRNAs. Studies of protein synthesis frequently utilize polyribosome analysis to shed light on the mechanisms of translation regulation or defects in protein synthesis. In this assay, mRNA/ribosome complexes are isolated from eukaryotic cells.  A sucrose density gradient separates mRNAs bound to multiple ribosomes known as polyribosomes from mRNAs bound to a single ribosome or monosome. Fractionation of the gradients allows isolation and quantification of the different ribosomal populations and their associated mRNAs or proteins. Differences in the ratio of polyribosomes to monosomes under defined conditions can be indicative of defects in either translation initiation or elongation/termination. Examination of the mRNAs present in the polyribosome fractions can reveal whether the cohort of individual mRNAs being translated changes with experimental conditions. In addition, ribosome assembly can be monitored by analysis of the small and large ribosomal subunit peaks which are also separated by the gradient. In this video, we present a method for the preparation of crude ribosomal extracts from yeast cells, separation of the extract by sucrose gradient and interpretation of the results.  This procedure is readily adaptable to mammalian cells.

This article describes a protocol for the extraction of translating ribosomes from eukaryotic cells. Once extracted, ribosomes are separated into monosomes and polyribosomes by sucrose gradient fractionation to allow different ribosomal populations to be analyzed. As such, this method is the gold standard for examining the regulation of translation.

Análisis eucariotas perfil Polyribosome

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or alkyne-tagged monosaccharides1, 2. The modified monosaccharides, processed by the glycan biosynthetic machinery, are incorporated into cell surface glycoconjugates. The bioorthogonal azide or alkyne tags then allow covalent conjugation with fluorescent probes for visualization, or with affinity probes for enrichment and glycoproteomic analysis. This protocol describes the procedures typically used for noninvasive imaging of fucosylated glycans in zebrafish embryos, including: 1) microinjection of one-cell stage embryos with GDP-5-alkynylfucose (GDP-FucAl), 2) labeling fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos with azide-conjugated fluorophores via biocompatible Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC), and 3) imaging by confocal microscopy3. The method described here can be readily extended to visualize other classes of glycans, e.g. glycans containing sialic acid4 and N-acetylgalactosamine5, 6, in developing zebrafish and in other living organisms.

A click-chemistry based method that allows for the rapid, noninvasive, and robust labeling of alkyne-tagged glycans in zebrafish embryos is described. Fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos in the late gastrulation stage were imaged in this study.

Glicanos imágenes en embriones de pez cebra mediante marcado metabólico y Química Haga clic Bioorthogonal

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

Análisis de la apoptosis en embriones de pez cebra en Todo el montaje de inmunofluorescencia para detectar la caspasa 3 activada

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Análisis de estrés oxidativo en embriones de pez cebra

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

Imaging semi-automatizado de fluorescencia específica de tejido en embriones de pez cebra

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for forward genetic analysis of developmental processes due to their external fertilization, embryonic size, rapid ontogeny, and optical clarity &#8211; a constellation of traits that enable the direct observation of events ranging from gastrulation to organogenesis with a basic stereomicroscope. Further, zebrafish embryos can survive for several days in the haploid state. The production of haploid embryos in vitro is a powerful tool for mutational analysis, as it enables the identification of recessive mutant alleles present in first generation (F1) female carriers following mutagenesis in the parental (P) generation. This approach eliminates the necessity to raise multiple generations (F2, F3, etc.) which involves breeding of mutant families, thus saving the researcher time along with reducing the needs for zebrafish colony space, labor, and the husbandry costs. Although zebrafish have been used to conduct forward screens for the past several decades, there has been a steady expansion of transgenic and genome editing tools. These tools now offer a plethora of ways to create nuanced assays for next generation screens that can be used to further dissect the gene regulatory networks that drive vertebrate ontogeny. Here, we describe how to prepare haploid zebrafish embryos. This protocol can be implemented for novel future haploid screens, such as in enhancer and suppressor screens, to address the mechanisms of development for a broad number of processes and tissues that form during early embryonic stages.

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

La producción de embriones de pez cebra mediante haploide<em&gt; In Vitro</em&gt; Fertilización

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...