Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave riguardanti la regolazione genetica della formazione e il mantenimento della barriera ematica-encefalica durante più fasi dello sviluppo della drosofila. Questo metodo può anche essere adattato per esaminare la permeabilità di altre barriere, come l'epitelio intestinale in una varietà di organismi. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente la valutazione della funzione di barriera eto-encefalica nei tessuti vivi.
La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, in quanto le manipolazioni di esempio possono essere difficili e molti passaggi richiedono molta attenzione ai dettagli. Per la raccolta degli embrioni posizionare un minimo di 50 femmine vergini con da 20 a 25 maschi per bottiglia con cibo Corn Meal Agar e incubare queste mosche per uno o due giorni prima di iniziare le collezioni. Il giorno prima della raccolta, scaldare i piatti di agar di succo di mela a 25 gradi Celsius durante la notte.
La mattina seguente trasferire le mosche anestetizzate di anidride carbonica in una gabbia di raccolta e posizionare un piatto di agar di succo di mela prerifavorato con un piccolo striscio di pasta di lievito all'estremità aperta della gabbia. Quindi fissare il piatto alla gabbia con la manica rossa. Per cancellare gli embrioni più vecchi, consenti alle mosche di deporre le uova su un piatto di agar di succo di mela per un'ora a 25 gradi Celsius.
Alla fine dell'incubazione, invertire il lato della rete della gabbia verso il basso e toccare le mosche sul fondo della gabbia. Sostituire l'agar succo di mela con un nuovo piatto di agar di succo di mela prerifamato con un piccolo striscio di pasta di lievito. Consenti alle mosche di deporre le uova sul nuovo piatto per un'altra ora a 25 gradi Celsius.
Per raccogliere 17 embrioni in fase avanzata per iniezione, sostituire la piastra di agar del succo di mela con un nuovo piatto pre-riscaldato con uno striscio di pasta di lievito. E consentire alle mosche di deporre le uova sul piatto a 25 gradi Celsius. Dopo un'ora, sostituire la piastra e invecchiare la piastra con embrioni raccolti per 19 ore a 25 gradi Celsius in modo che gli embrioni avranno dai 20 ai 21 ore al momento dell'imaging.
Al termine dell'incubazione di 19 ore, rimuovere la piastra di raccolta dell'embrione dall'incubatrice e coprire la superficie della piastra con PbTx. Utilizzare un pennello per allentare gli embrioni dalla superficie della piastra in un filtro a rete di nylon da 70 micrometri. E mettere il colino con embrioni in una soluzione di candeggina al 50% in una piastra di Petri di 100 millimetri per cinque minuti con agitazione occasionale a temperatura ambiente per dechorionate.
Al termine dell'incubazione, sciacquare gli embrioni tre volte ruotando il colino in PbTx fresco, utilizzando una nuova piastra di Petri per ogni lavaggio. Lavare gli embrioni su un lato del colino con PbTx e utilizzare una pipetta di vetro per trasferire gli embrioni su una lastra di gel di agarosio al 2%. Rimuovere il liquido in eccesso con carta da filtro.
Allineare da sei a otto embrioni sulla lastra con i posteriori a destra e i lati dorsali rivolti verso l'alto e premere saldamente un pezzo di nastro bipendo apposto su una diapositiva sopra gli embrioni. Quindi essiccare gli embrioni a temperatura ambiente per circa 25 minuti prima di coprire i campioni con olio di alocarbonio. Per la raccolta larvale, impostare una croce con da 5 a 10 mosche femminili vergini del genotipo desiderato e la metà dei maschi del genotipo desiderato in una fiala con cibo Cornmeal Agar.
Dopo cinque o sette giorni a 25 gradi Celsius, a seconda del genotipo, utilizzare le forcep per raccogliere delicatamente le terze larve instar errante dal flaconcino e risciacquare le larve con PBS per rimuovere qualsiasi cibo bloccato. Trasferire le larve su un piatto di agar succo di mela per genotipizzare se necessario prima di utilizzare un pennello per asciugare le larve su un tessuto. Quindi utilizzare le forcep per trasferire da sei a otto larve in una diapositiva preparata con nastro a doppia fronte.
Prima dell'iniezione, utilizzare un estrattore di micropipette per tirare i tubi capillari in una forma ad ago standard per le iniezioni di D.Melanogaster e ancorare gli aghi in argilla in una piastra di Petri. Per l'iniezione embrionale, utilizzare una punta di pipetta a caricamento in gel da 20 microlitri per caricare un ago preparato con 5 microlitri di 10 kilodalton dextran coniugati in cloruro acido sulforhodamina 101 e caricare l'ago in un portaaghi. Posizionare l'ago in un micromanipolatore fissato a una base di acciaio e impostare l'apparato di iniezione a 50 libbre per pollice quadrato e da 5 a 10 millisecondi con un intervallo di 10.
Posizionare lo scivolo sullo stadio del micromanipolatore e spazzolare il bordo dell'ago contro il bordo del nastro a doppia fronte con un angolo di 45 gradi per creare una punta leggermente angolata rotta quanto basta per consentire il flusso del dextran da 10 kilodalton attraverso l'apertura. Pompare il pedale fino a quando il colorante non è sulla punta dell'ago. Allineare l'ago in modo che sia parallelo all'embrione e forare l'estremità posteriore del campione.
Pompare il pedale per iniettare due nanolitri di colorante nel campione. Si noti il tempo di iniezione a scopo di incubazione e continuare lungo lo scivolo per iniettare campioni aggiuntivi. Per l'iniezione larvale, fare un'apertura angolata leggermente più grande di quella utilizzata per iniettare embrioni e inclinare leggermente l'ago verso il basso verso il campione prima di iniettare le larve con 220 nanolitri simili a quelli dimostrati per i campioni embrionali.
Al termine dell'incubazione a iniezione di 10 minuti, utilizzare un applicatore con punta di cotone per applicare vaselina sul lato destro e sinistro dei campioni sullo scivolo come distanziale. Posizionare lo slittamento del coperchio sopra e posizionare lo scivolo sullo stadio del microscopio confocale. Seleziona l'obiettivo 20X e immagini i campioni per tutta la profondità di ogni embrione.
Quindi calcola la percentuale di campioni con una barriera emato-encefalica compromessa secondo la formula. Prima di iniziare la procedura di dissezione, utilizzare lo smalto per montare due scivolamenti di copertura distanziati di circa 0,5 centimetri su uno scivolo e posizionare una larva iniettata in PBS sullo scivolo alla fine dell'incubazione di 30 minuti. Usando un paio di forcep, afferrare la larva a metà del corpo larvale e utilizzare una seconda coppia di forcep per separare le metà anteriore e posteriore della larva.
Successivamente, utilizzare un paio di pinze per afferrare la regione anteriore ai ganci della bocca e utilizzare la seconda coppia di pinze per invertire la parete del corpo sulla punta della prima coppia di pinze. Il cervello e il cordone nervoso ventrale saranno esposti. Separare il cervello e il cordone nervoso ventrale dalla parete del corpo tagliando i nervi se necessario e rimuovere la parete corporea dallo scivolo.
Coprire il campione con 10 microlitri di glicerolo all'80%. Quindi posizionare un foglietto di copertura sopra il campione per l'imaging e immaginare i campioni per determinare la percentuale di campioni con una barriera emato-encefalica compromessa come dimostrato. Quando gli embrioni di tipo selvatico in fase avanzata 17 vengono iniettati con 10 kilodalton dextran coniugati in colorante fluorescente al cloruro acido solforato 101, la grande molecola di dextran è esclusa dal cordone nervoso ventrale, come previsto.
Eterozigoti embrioni mutanti grezzi 1 mostrano una barriera ematico-encefalica intatta, simile a quella osservata negli embrioni di controllo del tipo selvatico. Al contrario, gli embrioni mutanti grezzi omozigoti 1 presentano difetti nell'integrità della barriera ematico-encefalica, con il dextran di 10 kilodalton che si inonda nel cordone nervoso ventrale, indicando un fallimento della barriera ematico-encefalica per formarsi. Nei campioni larvali di controllo del tipo selvaggio, 10 kilodalton dextran non riescono a penetrare nella barriera emato-encefalica ed è escluso dal cervello e dal cordone nervoso ventrale.
Quando si tenta questa procedura, un corretto invecchiamento degli embrioni è fondamentale per garantire che i campioni siano esaminati ad un'età in cui si prevede che la formazione di barriere ematiche-encefalica sia completa. Seguendo questa procedura, i mutanti che presentano una barriera emato-encefalica compromessa possono essere ulteriormente studiati usando genetica, immunoistochimica e microscopia per comprendere meglio la funzione genica a livello cellulare. Questa tecnica consentirà ai ricercatori di identificare geni aggiuntivi che sono fondamentali per la creazione e il mantenimento della barriera ematico-encefalica.
