이 방법은 drosophila 발달의 다중 단계 도중 혈액 두뇌 장벽의 형성 그리고 유지의 유전 규칙에 관하여 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 방법은 또한 다양한 유기체에서 장 상피와 같은 다른 장벽의 투과성을 검사하도록 조정할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 살아있는 조직에서 혈액 뇌 장벽 기능의 평가를 허용한다는 것입니다.
샘플 조작이 어려울 수 있으며 많은 단계에서 세부 사항에 주의를 기울여야 하기 때문에 이 방법의 시각적 데모는 매우 중요합니다. 배아 수집의 경우 옥수수 식사 Agar 음식과 병 당 20 ~ 25 수컷과 최소 50 처녀 여성을 배치하고 컬렉션을 시작하기 전에 1 ~ 2 일 동안이 파리를 배양. 컬렉션 전날, 따뜻한 사과 주스 한천 접시는 하룻밤 사이에 섭씨 25도입니다.
다음 날 아침, 마취된 이산화탄소를 컬렉션 케이지로 옮기고 케이지의 열린 끝에 효모 페이스트의 작은 얼룩이 있는 미리 따뜻진 사과 주스 한천 접시를 놓습니다. 그런 다음 빨간색 소매로 케이지에 접시를 고정합니다. 오래된 배아를 지우려면 파리가 섭씨 25도에서 1시간 동안 사과 주스 한천 접시에 알을 놓도록 하십시오.
인큐베이션이 끝나면 케이지 메쉬 측면을 거꾸로 뒤집어 파리를 케이지 바닥으로 누릅니다. 사과 주스 한고를 새로운 미리 데운 사과 주스 한천 접시에 작은 효모 페이스트 얼룩으로 바꿉니다. 파리가 섭씨 25도에서 새로운 접시에 알을 낳을 수 있도록 하십시오.
주사를 위해 늦은 단계 17 배아를 수집하려면 사과 주스 한천 판을 효모 페이스트 얼룩으로 새로운 미리 데운 접시로 교체하십시오. 그리고 파리가 섭씨 25도에서 접시에 알을 낳을 수 있도록 하십시오. 1 시간 후에, 배아가 화상 진찰시 20-21 시간 오래 될 수 있도록 25섭씨에서 19 시간 동안 수집된 배아로 접시와 나이를 대체하십시오.
19시간 배양끝에 인큐베이터에서 배아 수집 판을 제거하고 PbTx로 플레이트 표면을 덮습니다. 그리고 배아를 가진 여과기를 100mm 페트리 접시에 5분간 놓고 실온에서 가끔 동요하여 비틀거림을 합니다.
인큐베이션이 끝나면 신선한 PbTx에서 여과기를 소용돌이치며 각 세척에 새로운 페트리 접시를 사용하여 배아를 세 번 헹구십시오. 배아를 PbTx로 여과기의 한쪽으로 씻고 유리 파이펫을 사용하여 배아를 2% 아가로즈 젤 슬래브로 옮겨 보세요. 필터 용지로 여분의 액체를 제거합니다.
슬래브에 6~8개의 배아를 오른쪽에 후방과 등쪽면이 위로 향하고 배아 위에 있는 슬라이드에 부착된 양면 테이프 조각을 단단히 누릅니다. 그런 다음 할로탄소 오일로 표본을 덮기 전에 약 25 분 동안 실온에서 배아를 담가합니다. 애벌레 컬렉션의 경우, 원하는 유전자형의 5~10처녀 암컷 파리와 콘밀 아가 음식과 유리병에 원하는 유전자형의 절반의 수컷으로 십자가를 설치합니다.
유전자형에 따라 섭씨 25도에서 5~7일 후에는 집게를 사용하여 바이알에서 방황하는 세 번째 인스타 애벌레를 부드럽게 수집하고 PBS로 애벌레를 헹구어 붙어있는 음식을 제거하십시오. 애벌레를 사과 주스 한천 접시에 옮겨 필요에 따라 지노티핑을 한 후 페인트 브러시를 사용하여 조직에 유충을 말리십시오. 그런 다음 집게를 사용하여 6-8 개의 애벌레를 양면 테이프로 준비된 슬라이드로 옮길 수 있습니다.
주입 하기 전에, 마이크로 피펫 풀러를 사용 하 여 D.Melanogaster 주사에 대 한 표준 바늘 모양으로 모세관 튜브를 당기 고 페트리 접시에 점토에 바늘을 고정. 배아 주입의 경우 20 마이크로리터 젤 로딩 파이펫 팁을 사용하여 10킬로달톤 디엑스트라5마이크로리터가 있는 준비된 바늘을 적재하여 설포호다민 101산 염화산염화물을 바늘 홀더에 적재하십시오. 바늘을 강철 베이스에 고정된 미세 조작기에 배치하고 주입 장치를 평방 인치당 50 파운드, 10의 범위로 5 ~ 10 밀리초로 설정합니다.
마이크로 조작기 단계에 슬라이드를 놓고 바늘가장자리를 45도 각도로 양면 테이프의 가장자리에 브러시하여 개구부를 통해 10 킬로달톤의 흐름을 허용할 만큼 약간 각진 팁을 만듭니다. 염료가 바늘 끝에 놓일 때까지 발 페달을 펌프합니다. 바늘을 정렬하여 배아와 평행하게 하고 시편의 후면 끝을 뚫는다.
발 페달을 펌핑하여 두 나노리터의 염료를 시편에 주입합니다. 인큐베이션 을 위해 주입 시간을 기록하고 슬라이드를 계속 하여 추가 표본을 주입하십시오. 애벌레 주사의 경우, 배아 시편에 입증된 것과 유사한 220 나노리터로 유충을 주입하기 전에 배아를 주입하고 바늘을 시편쪽으로 약간 아래쪽으로 각도로 사용하는 것보다 약간 더 큰 각개 구각을 한다.
10분 주입 배비치가 끝나면 면 기울어진 어플리케이터를 사용하여 슬라이드의 시료의 오른쪽과 왼쪽에 페트롤젤리를 스페이서로 적용합니다. 커버 슬립을 위에 놓고 슬라이드를 공초점 현미경 단계에 놓습니다. 20X 목표를 선택하고 각 배아의 깊이에 걸쳐 샘플을 이미지합니다.
그런 다음 공식에 따라 손상된 혈액 뇌 장벽으로 샘플의 백분율을 계산합니다. 해부 절차를 시작하기 전에 매니큐어를 사용하여 슬라이드에 약 0.5센티미터 간격의 두 개의 커버 슬립을 장착하고 주입 된 유충을 30 분 배큐베이션 끝에 슬라이드에 PBS에 넣습니다. 한 쌍의 집게를 사용하여 애벌레 몸의 중간쪽을 잡고 두 번째 포셉을 사용하여 애벌레의 앞쪽과 후방 반쪽을 분리합니다.
다음으로, 한 쌍의 집게를 사용하여 입 후크에서 전방 영역을 잡고 두 번째 봉구를 사용하여 첫 번째 집게 의 끝 위에 바디 벽을 반전시면 됩니다. 뇌와 복부 신경 코드가 노출됩니다. 필요한 경우 신경을 분리하여 뇌와 복부 신경 코드를 신체 벽에서 분리하고 슬라이드에서 신체 벽을 제거하십시오.
80%의 글리세롤10마이크로리터로 샘플을 덮습니다. 그런 다음 이미징을 위한 샘플 위에 커버 슬립을 배치하고 시료를 이미지하여 손상된 혈액-뇌 장벽이 있는 샘플의 백분율을 입증합니다. 야생형 후기 단계 17배아가 설포호다민 101산 염화형염으로 10킬로달톤 드엑스트라넨을 주입하면, 큰 단부 분자는 복부 신경코드에서 제외된다.
이테로지구스 원시 1 돌연변이 배아는 야생 형 대조군 배아에서 관찰된 것과 유사한 온전한 혈액-뇌 장벽을 나타낸다. 대조적으로, homozygous 원시 1 돌연변이 태아는 혈액-뇌 장벽의 무결성에 결함을 전시, 와 함께 10 킬로달톤 dextran 복부 신경 코드에 홍수, 형성 하는 혈액-뇌 장벽의 실패를 나타내는. 야생 형 대조군 애벌레 샘플에서, 10 킬로달톤 dextran는 혈액 뇌 장벽을 관통하는 데 실패하고 뇌와 복부 신경 코드에서 제외됩니다.
이 절차를 시도할 때, 태아의 적당한 노화는 혈액 두뇌 장벽 형성이 완료될 것으로 예상되는 나이에 견본이 검토되는지 확인하기 위하여 중요합니다. 이 절차에 따라, 손상된 혈액-뇌 장벽을 전시 하는 돌연변이 는 세포 수준에서 유전자 기능을 더 잘 이해 하기 위해 유전학을 사용 하 여 공부할 수 있습니다., 면역 조직 화학, 그리고 현미경 검사. 이 기술은 연구원이 혈액-두뇌 장벽의 설치 그리고 유지 를 위해 중요한 추가 유전자를 확인하는 것을 허용할 것입니다.
