Bu protokol, telomerlerde protein kondensatlarını indük etmek için kimyasal dimerizasyon sistemini açıklar. Diğer genomik locilerde yoğuşmalara neden olmak için kolayca uyarlanabilir ve kromatin ilişkili kondensatların oluşumunu ve işlevini yoklamak için uygundur. Bu yöntem canlı hücre görüntüleme için gerekli zamansal çözünürlüğü sunar ve biyokimyasal tahliller için hücre popülasyonunda faz ayrımını sağlar.
Başlamak için, DMSO'daki dimerizatörleri 10 milimolar olarak çözün ve uzun süreli depolama için eksi 80 santigrat derecede plastik mikrosantrifüj tüplerinde saklayın. Görüntüleme ortamında 10 milimolar dimerizer'lık bir aliquot'ı 10 mikromolar stok konsantrasyonuna seyreltin ve eksi 20 santigrat derecede saklayın. Kullanıma hazır olduğunuzda, dimerizerleri büyüme ortamında veya görüntüleme ortamında 100 nanomolar nihai çalışma konsantrasyonuna seyreltin.
Tohum 10'dan beşinci hücrelere 12 milimetre çapında dairesel kapak camları altı kuyulu bir plakada Poli-D-Lizin ile kaplanmıştır. Daha sonra hücreleri Halo-GFP-TRF1 ve mCherry-eDHFR-SIM veya mCherry-eDFR-SIM mutant plazmidleri ile transfect ve immünofluoresansa geçmeden önce 24 ila 48 saat bekleyin. Seyreltilmiş 100 nanomoler dimerizörü hücrelere ekleyin ve dört ila beş saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.
kuluçkadan sonra, hücrelerin dengesini sağlamak için oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 4 formaldehit ve% 0.1 Triton X-100 içeren PBS çözeltisinde hücreleri sabitleyin. Ardından hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. Yıkama kapağı iki kez 50 mikrolitre TBS-Tx ve bir kez de 50 mikrolitre antikor seyreltme tamponu ile kayar.
Her kapak kaymasını bir gecede nemlendirilmiş bir odada 50 mikrolitre birincil anti-PML, anti-SUMO-1 veya anti-SUMO-2 ve 3 antikoru ile dört santigrat derecede inkübte edin. İlişkisiz birincil antikoru çıkarmak için antikor seyreltme tamponu ile üç kez kapak kaymaları yıkayın, ardından hücreleri oda sıcaklığında karanlık bir kutuda bir saat boyunca ikincil antikorla kuluçkaya yatırın. Boyamadan sonra, yıkama kapağı TBS-Tx ile üç kez kayar.
Mililitre DAPI başına bir mikrogramdan iki mikrolitre ekleyerek slaytları etiketleyin, ardından kapak kaymalarını ters çevirin ve DAPI damlasına yerleştirin. Kapak kaymasının kenarından ekstra sıvı epire edin. Kaydırağı oje ile kapatın, kurumasını bekleyin ve kapak kaymasının üst kısmını suyla durulayın.
Slaytları görüntülemeye kadar dondurucuya yerleştirin. Tohum 10'dan beşinci hücrelere 12 milimetrelik dairesel kapak camları altı kuyulu bir tabakta Poly-D-Lizin ile kaplanmış ve halo-TRF1 ve mCherry-eDHFR-SIM veya mCherry-eDHFR-SIM mutant plazmidlerle transfect. Hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 4 formaldehit ile sabitleyin ve PBS ile dört kez yıkayın.
IF-FISH için, hücreleri birincil ve ikincil antikorlarla lekeleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 4 formaldehit ile refix edin, ardından PBS ile dört kez yıkayın ve kapak kaymalarını bir etanol serisinde susuz bırakın. Kapak kaymalarını 488 telomer C-PNA probu ile beş dakika boyunca 75 santigrat derecede beş mikrolitre hibridizasyon çözeltisinde kuluçkaya yatırın, ardından kapak kaymalarını oda sıcaklığında nemlendirilmiş bir odada bir gecede kuluçkaya yatırın. Kapak kaymalarını oda sıcaklığında yıkama başına iki dakika yıkama tamponu ile üç kez yıkayın ve görüntüleme için montaj ortamlarına mililitre DAPI başına bir mikrogram ile monte edin.
Canlı görüntüleme için, kapak kaymalarını manyetik odalara bir çevre odasında ısıtılmış bir aşamaya monte edin ve hücreleri fenol kırmızısı olmadan bir mililitre görüntüleme ortamında saklayın. Metin el yazmasında açıklandığı gibi mikroskop ve çevre kontrol cihazını kurun. Telomerlerde parlak bir GFP sinyali ve sitozolde difüzör mCherry sinyali olan hücreleri bulun.
XYZ bilgileriyle her pozisyonu ezberleyen yaklaşık 20 hücre bulun ve hızlandırılmış görüntüleme için parametreler ayarlayın. Z'de toplam sekiz mikrometre için 0,5 mikrometre aralığı ve hem GFP hem de mCherry kanalları için iki ila dört saat boyunca beş dakikalık zaman aralığı kullanın. 594 nanometrenin %30'unu ve 488 nanometre güç yoğunluğunun %50'sini kullanın, pozlama süreleri 200 milisaniye ve kamera kazancı 300'dür.
Görüntülemeye başlayın ve bir zaman döngüsünü ön dimerizasyon olarak alın. Daha sonra görüntülemeyi duraklatın, görüntüleme odasına 15 mikrolitre 10 mikromoler dimerizer içeren 0,5 mililitre görüntüleme ortamı ekleyin, sahneye dokunmamaya dikkat edin ve görüntülemeye devam edin. Dimerizasyonu tersine çevirmeye hazır olduğunuzda, görüntülemeyi duraklatın ve görüntüleme odasına 100 milimoler stok TMP'nin iki mikrolitresini içeren 0,5 mililitre görüntüleme ortamı ekleyin.
Hücreleri görüntülemeye bir ila iki saat devam edin. Sabit görüntüleme için, canlı görüntüleme ile aynı mikroskop kurulumunu kullanın, ancak sahne ısıtması olmadan. Transfected hücreler için seçmek için kırmızı sinyal ile yaklaşık 30 ila 50 hücre bulun.
Z.Use'ta toplam sekiz mikrometre için 0,3 mikrometre aralığına sahip görüntüler elde edin. SUMO'nun telomer lokalizasyonu telomer DNA FISH ve SUMO protein immünofluoresansı kullanılarak belirlendi. SIM işe alımına sahip hücreler, SIM mutant işe alımına sahip hücrelere kıyasla SUMO-1 ve SUMO-2 ve 3'ü zenginleştirmiş, bu da TELOMERLERDE SIM dimerizasyonuna bağlı SUMO zenginleştirmenin SUMO-SIM etkileşimlerine bağlı olduğunu gösterir.
Burada, küçültme sonrası TRF-1 ve SIM'in hızlandırılmış bir filmi gösterilmiştir. SIM telomerlere başarıyla alındı ve sıvı damlacık oluşumu ve büyümesi için öngör edildiği gibi hem SIM hem de TRF-1 odakları daha büyük ve parlak hale geldi. Ayrıca, telomere sayısının azalmasında ve zamanla artan telomer yoğunluğunda gösterildiği gibi telomer kümelenmesine yol açan TRF-1 odaklarının füzyonu gözlenmiştir.
Buna karşılık, SIM mutant dimerizasyondan sonra telomerlere alındı, ancak faz ayrımı ve telomer kümelemenin SUMO-SIM etkileşimleri tarafından yönlendirdiğini gösteren herhangi bir damlacık oluşumuna veya telomer kümelenmesine neden olmadı. Faz ayrımı ve telomer kümelemenin tersine dönmesi, fazla serbest TMP ekledikten sonra gözlendi. Telomer sayısı arttı ve telomer yoğunluğu zamanla azaldı.
Telomer DNA FISH ve PML protein IF ile tanımlanan API'lerin temsili görüntüleri burada gösterilmiştir. SIM'in işe alındığı hücreler, SIM mutant işe alınan hücrelerden daha fazla API'ye sahiptir, bu da küçültme kaynaklı kondensatların gerçekten API'ler olduğunu düşündürmektedir. Bu protokolü gerçekleştirirken ışığa duyarlı karartıcıları ışığa maruz bırakmayın.
Kırmızı ışık yayan bir lamba ile karanlık bir odada çalışın ve kuluçka sırasında hücreleri alüminyum folyo ile sarın. Bu yordamı takiben, yakınlık etiketlemesi, indüklenen kondensattaki bileşenlerin kapsamlı bir listesini oluşturmak için kullanılabilir. Canlı görüntüleme, yoğuşmadaki bileşenlerin dinamiklerini takip etmek için kullanılabilir.
Bu yöntemler, yoğuşma kompozisyon denetimini yönetme rollerini belirlemeye yardımcı olabilir.
