이 프로토콜은 텔로미어의 단백질 응축수들을 유도하는 화학 적 이압 시스템을 설명합니다. 다른 게놈 로치에 응축수를 유도하도록 쉽게 적응할 수 있으며 크로마틴 관련 응축수의 형성 및 기능을 조사하는 데 적합합니다. 이 방법은 살아있는 세포 화상 진찰에 필요한 시간적 해결책을 제공하고 생화학적 분석을 위한 세포의 인구에 있는 상 분리를 유지합니다.
우선 DMSO의 이질화를 10밀리머로 녹여 플라스틱 미세원심분리기 튜브에 보관하여 장기 보관을 위해 섭씨 영하 80도에 저장하십시오. 이미징 매체에서 10 밀리머 이머제의 알리쿼트를 10 마이크로몰라의 육수 농도로 희석하고 영하 20도에 보관하십시오. 사용할 준비가 되면 이머제는 성장 중간 또는 이미징 매체에서 100 나노몰러의 최종 작동 농도로 희석합니다.
6웰 플레이트에 폴리-D-리신으로 코팅된 12밀리미터 직경의 원형 커버 안경으로 5번째 셀에 10번 시드를 드시고 있습니다. 그런 다음 Halo-GFP-TRF1 및 mCherry-eDHFR-SIM 또는 mCherry-eDFR-SIM 돌연변이 플라스미드로 세포를 횡단하고 면역형광을 진행하기 전에 24~48시간을 기다립니다. 희석된 100 나노몰러 이머제를 세포에 추가하고 4~5시간 동안 섭씨 37도에서 배양합니다.
인큐베이션 후, 세포를 포름알데히드 4%와 0.1%트리톤 X-100을 함유한 PBS 용액에서 세포를 실온에서 10분 동안 수정하여 세포를 투과화한다. 그런 다음 PBS로 셀을 세 번 씻으시면 됩니다. 세척 커버는 TBS-Tx의 50 마이크로 리터와 한 번 항체 희석 버퍼의 50 마이크로 리터와 함께 두 번 미끄러집니다.
각 커버 슬립을 1차 항PML, 반대로 SUMO-1 또는 반수모-2 및 3항체를 가습 챔버에서 밤새 4도의 섭씨로 배양한다. 세척 커버는 언바운드 1차 항체를 제거하기 위해 항체 희석 버퍼로 세 번 미끄러진 다음 실온의 어두운 상자에 1 시간 동안 이차 항체로 세포를 배양합니다. 염색 후, 세탁 커버는 TBS-Tx로 세 번 미끄러짐.
라벨은 밀리리터 DAPI당 1마이크로그램의 마이크로리터 2개를 추가한 다음 커버 슬립을 뒤집어 DAPI 드롭에 놓습니다. 커버 슬립의 가장자리에서 여분의 유체를 흡인. 매니큐어로 슬라이드를 밀봉하고 건조시키고 커버 슬립의 상단을 물로 헹구십시오.
슬라이드를 이미징할 때까지 냉동실에 놓습니다. 종자 10 에 다섯 번째 세포에 12 밀리미터 원형 커버 안경 6 웰 플레이트에 폴리 D-리신 코팅 하 고 헤일로-TRF1 및 mCherry-eDHFR-SIM 또는 mCherry-eDHFR-SIM 돌연변이 플라스미드와 함께 그들을 transfect. 실온에서 10 분 동안 4 %의 포름 알데히드로 세포를 고정하고 PBS로 4 번 세척하십시오.
IF-FISH의 경우, 1차 및 이차 항체로 세포를 염색하고 실온에서 10분 동안 4%포름알데히드로 재고한 다음 PBS로 4번 세척하고 에탄올 계열에서 커버 슬립을 탈수합니다. 커버 슬립488 텔로미어 C-PNA 프로브를 5분간 섭씨 75도에서 5마이크로리터의 마이크로리터로 배양한 다음 실온에서 가습된 챔버에서 밤새 커버 슬립을 배양합니다. 커버슬립을 실온에서 세척당 2분 동안 세척 버퍼로 세 번 세척하고 이미징을 위한 마운팅 미디어에 밀리리터 DAPI당 1마이크로그램으로 장착합니다.
라이브 이미징의 경우, 페놀 레드 없이 이미징 매체의 1밀리리터에서 세포를 유지, 환경 챔버에서 가열 된 단계에 자기 챔버에 커버 슬립을 마운트. 텍스트 원고에 설명된 바와 같이 현미경 및 환경 제어 장치를 설정합니다. 시토솔의 텔로미어 및 확산 mCherry 신호에 밝은 GFP 신호가 있는 세포를 찾습니다.
약 20개의 세포를 찾아 XYZ 정보로 각 위치를 암기하고 시간 경과 이미징을 위한 매개변수를 설정합니다. GFP 및 mCherry 채널 모두에서 2~4시간 동안 Z에서 총 8마이크로미터, 5분 간격에 0.5 마이크로미터 간격을 사용하십시오. 594 나노미터의 30%와 488나노미터 전력 강도의 50%를 사용하며, 노출 시간은 200밀리초, 카메라 게인은 300입니다.
이미징을 시작하고 사전 이산화로 한 번 루프를 수행합니다. 그런 다음 이미징을 일시 중지하고, 10 마이크로 몰라 이량제의 15 마이크로 리터를 포함하는 이미징 미디어의 0.5 밀리리터를 이미징 챔버에 추가하고, 단계를 만지지 않도록주의하고, 이미징을 재개합니다. 이산화를 되돌릴 준비가 되면 이미징을 일시 중지하고 100 밀리머 스톡 TMP의 2개의 마이크로리터를 포함하는 이미징 미디어의 0.5 밀리리터를 이미징 챔버에 추가합니다.
세포를 1~2시간 동안 계속 이미징합니다. 고정 이미징의 경우, 라이브 이미징과 동일한 현미경 설정을 사용하지만 단계 가열없이 사용합니다. 전감염된 세포를 위해 선택하기 위해 적색 신호를 가진 약 30~50개의 세포를 찾습니다.
Z.Use 647 나노미터의 80%, 561 나노미터의 80%, 488 나노미터 전력 강도의 70%를 600밀리초, 카메라 이득 300에서 총 8마이크로미터간격으로 0.3 마이크로미터 간격으로 이미지를 획득한다. SUMO의 텔로메릭 국소화는 텔로미어 DNA FISH 및 SUMO 단백질 면역형광을 사용하여 확인되었다. SIM 모집을 가진 세포는 SIM 돌연변이 모집을 가진 세포에 비해 SUMO-1 및 SUMO-2 및 3을 풍부하게 하고, 말소미어에 대한 SIM 이수화가 유도된 SUMO 농축이 SUMO-SIM 상호 작용에 달려 있음을 나타냅니다.
이산화 후 TRF-1 및 SIM의 타임랩스 영화가 여기에 표시됩니다. SIM은 텔로미어에 성공적으로 채용되었으며, 액체 액적 형성과 성장에 대한 예측대로 SIM과 TRF-1 foci가 더 크고 밝아졌습니다. 또한, TRF-1 포시의 융합이 관찰되었고, 이는 텔로미어 클러스터링으로 이어졌으며, 이는 시간이 지남에 따라 텔로미어 수 감소 및 텔로미어 강도 증가와 같이.
대조적으로, SIM 돌연변이는 분수 후에 텔로미어로 모집되었지만, 어떤 물방울 형성 또는 텔로미어 클러스터링을 유도하지 않았으며, 이는 상 분리 및 텔로미어 클러스터링이 SUMO-SIM 상호 작용에 의해 구동된다는 것을 나타낸다. 상 분리 및 텔로미어 클러스터링의 반전은 초과 무료 TMP를 추가한 후 관찰되었다. 텔로미어 수가 증가하고 텔로미어 강도는 시간이 지남에 따라 감소했습니다.
텔로미어 DNA FISH 및 PML 단백질 IF에 의해 확인된 APB의 대표적인 심상은 여기에서 도시된다. SIM을 모집한 세포는 SIM 돌연변이를 채용한 세포보다 더 많은 APB를 가지고 있으며, 이압 유도 응축은 실제로 APB입니다. 이 프로토콜을 수행할 때는 빛에 민감한 이질자를 라이트에 노출시키지 마십시오.
잠복하는 동안 붉은 빛을 방출하고 알루미늄 호일로 세포를 감싸는 램프가있는 어두운 방에서 작업하십시오. 이 절차에 따라 근접 라벨링을 사용하여 유도된 응축수에서 포괄적인 구성 요소 목록을 생성할 수 있습니다. 라이브 이미징은 응축수의 구성 요소의 역학을 따르는 데 사용할 수 있습니다.
이러한 메서드는 응축수 조성 제어를 제어하는 역할을 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다.
