ミトコンドリアは、独自のDNAを持っているにもかかわらず、核ゲノムに大きく依存しています。したがって、高度に規制された輸入メカニズムが必要です。この方法は、プロセスを研究し、それが外部刺激にどのように適応することができるかを研究するのに役立ちます。
これは、ミトコンドリアの様々なサブコンパートメントへのタンパク質の輸入を定量的に評価するために利用可能な唯一の生化学的技術です。ミトコンドリアの生存率は様々な疾患状態に関係しているため、タンパク質の輸入がどのように調節されているかを理解することは、ミトコンドリアを標的とする新しい治療アプローチに寄与する可能性がある。ミトコンドリアの生存率と完全性を確保するために、分離中に特別な注意が必要です。
組織を徹底的に細かく切り、その後のすべてのペレットを穏やかに再懸濁させる必要があります。この手順をデモンストレーションすることは、私の研究室の博士課程の学生であるアシュリー・オリベイラです。骨格筋からミトコンドリアを分離するには、筋肉から脂肪と結合組織を取り除き、均質なスラリーになるまで冷やされた時計ガラスの組織をミンチします。
細切り組織を冷やした50ミリリットルのプラスチック遠心チューブに入れ、正確な重量を記録します。次いで、ATPを含む緩衝液1で細かく組織を10倍に希釈する。8ミリメートルの双刃ホモジナイザーを使用して、9.8ヘルツの出力で筋肉サンプルを10秒間均質化し、筋肉の目に見える塊が残らないようにします。
9,000x Gで試料を摂氏4度で10分間回転させた後、ペレットを約95マイクロリットルの再懸濁液培地中に慎重に再懸濁する。上清を捨てる前にサンプルを遠心分離し、P-200ピペットを用いて約180マイクロリットルの再懸濁液を用いてペレットを穏やかに再懸濁した。in vitro翻訳では、ミトコンドリアのサンプルあたり20マイクロリットルを供給し、インポート実験や翻訳レーンに使用するのに十分な翻訳反応ミックスを準備します。
インキュベーションの反応を摂氏30度で30分間置きます。翻訳反応開始から15分後、90マイクログラムのミトコンドリアを無菌1.5ミリリットルチューブにアリコートし、摂氏30度で10分間予めインキュベートする。無菌1.5ミリリットルチューブの新鮮なセットでは、ミトコンドリアの75マイクログラムと18マイクロリットルの翻訳反応を組み合わせ、所望の時間のために摂氏30度でチューブをインキュベートします。
翻訳反応の残量を氷の上に保管してください。適切なインキュベーション時間後にインポート反応を終了するには、30°Cからチューブを取り出して氷の上に置き、スクロースクッションでチューブの上に慎重に輸入反応を移します。スクロースクッションを17,000x Gで摂氏4度で15分間遠心分離します。
P-1000ピペットを使用して、ペレットを邪魔することなく上清を慎重に除去します。外膜にインポートするには、Tom40に使用して反応を行い、調製したての0.1モル炭酸ナトリウムの50マイクロリットルでペレットを再懸濁し、氷上で30分間インキュベートする。インキュベーションに続いて、摂氏4度で5分間14,000xGでサンプルを遠心分離する。
次に、原稿に記載されているとおりにSDS-PAGE電気泳動用のサンプルを調製する。残りの翻訳反応の3マイクロリットルを37マイクロリットルのリシスバッファーと5マイクロリットルのサンプル色素と混合して、制御翻訳レーンを準備します。サンプルを摂氏95度で5分間沸騰させ、ミトコンドリアをペレット化しないように低速で軽く回転させます。
サンプルをSDSポリアクリルアミドゲルに塗布した後、5%トリクロロ酢酸(TCA)でヒュームフードでゲルを沸騰させ、連続撹拌しながら5分間煮ます。次に、ゲルを回転板の上に2倍蒸留水に入れ、毎分50回転で1分間置きます。回転板の10ミリモルトリスでゲルを毎分50回転で5分間洗います。
タンパク質を沈殿させるには、ゲルを回転板で30分間覆うのに十分な量の1モルサリシン酸でゲルを洗います。ゲルを脱水するには、ゲルドライヤーの多孔質ベッドに大きなブロッティングペーパーを置き、ゲルを塗布する領域にペーパータオルを1枚置きます。その後、11センチを9センチのブロッティング紙で切り、ペーパータオルの上に置きます。
11センチメートル×9センチメートルのブロッティング紙の2番目の部分を使用して、容器からゲルをすくい取り、ゲルを最初の部分の上に平らに置きます。少し大きなプラスチックをゲルの上に置き、ラップの下に折り目や泡を入れないようにします。次に、ゲルドライヤーのプラスチックカバーをラップの上に置きます。
真空をオンにします。プラスチックカバーの角を持ち上げ、カバーが再シールするのを待つことにより、プラスチックカバーがシールを形成していることを確認します。ゲルドライヤーを閉じて90分間、摂氏30度から徐々に摂氏80度に達し、ラン終了時に摂氏30度に戻ります。
乾燥工程で使用したラップでゲルを包みます。脱水するとゲルが固まり、紙が薄く感じるようにします。脱水ゲルを上にリンフィルムを付けたカセットに入れる。
リンイメージングが可能な任意の適切なイメージャーでオートラジオグラフィーを使用してゲルを可視化する前に、24時間フィルムを露出させます。代表的な分析は、サブサルコレムおよびミトコンドリアのマレートデヒドロゲナーゼ(MDH)の正常な輸入速度と前駆体MDHの翻訳産物を示す。バリノマイシンの添加は、SSおよびIMFミトコンドリアのマトリックスへのMDHタンパク質のインポートを阻害した。
同様に、洗浄剤Triton Xは、内膜の可溶化のために両方のサブ画分へのMDH輸入を阻害した。タンパク質のインポートの推定は、時間の持続時間の増加のために行われ、その結果のデータは、インポートは時間依存のプロセスであり、SSとIMFミトコンドリアは、インポートのための異なるレートまたは容量を持っていることを示しました。ラットが電気刺激を受けたとき、Tom 40は、コントロールと比較して慢性的に刺激された動物からの筋肉中に外膜にインポートした。
オルニチントランスカルバミラーゼ、またはOCTインポートは、ミトコンドリアマトリックスへのインキュベーションの各時点で増加し、慢性的に刺激された筋肉からのミトコンドリアの1.4倍の増加をもたらした。タンパク質のインポートは、ミトコンドリア含有量の指標と正の相関を持ち、COX活性によって評価された。ミトコンドリア介在アポトーシスの調査において、BaxとBakダブルノックアウト動物はミトコンドリアマトリックスへのタンパク質輸入を減少させた。
6週間の自主的な車輪の走行は、二重ノックアウト動物の輸入欠陥を救出しました。インポート反応の持続時間やインポートするタンパク質などの変数を考慮することが重要です。細胞種分画は、細胞細胞の要因が輸入速度に影響を与える可能性を理解するために反応に組み込むことができます。
あるいは、タンパク質が選択的にインポートされる方法を理解するために、インキュベーションの前にタンパク質を改変してもよい。この技術は、様々な疾患状態で存在し得るミトコンドリアミオパチーの複雑な病因を理解するのに役立つ。
