Sequenziale Applicazione di vetrini di vetro per valutare la compressione Rigidità della lente Mouse: Strain e morfometriche analisi

Riepilogo

Age-related increases in eye lens stiffness are linked to presbyopia. This protocol describes a simple, cost-effective method for measuring mouse lens stiffness. Mouse lenses, like human lenses, become stiffer with age. This method is precise and can be adapted for lenses from larger animals.

Abstract

La lente occhio è un organo trasparente che rifrange e si concentra la luce per formare una chiara immagine sulla retina. Negli esseri umani, contratto di muscoli ciliari deformare la lente, portando ad un aumento della potenza ottica della lente di concentrarsi su oggetti vicini, un processo noto come alloggio. Cambiamenti legati all'età in rigidità lente sono stati collegati a presbiopia, una riduzione nella lente 'possibilità di ospitare, e, per estensione, la necessità di occhiali da lettura. Anche se le lenti del mouse non ospitare o sviluppare presbiopia, modelli di mouse in grado di fornire uno strumento genetico prezioso per patologie lenti comprensione, e l'invecchiamento accelerato osservato nei topi permette lo studio dei cambiamenti legati all'età nella lente. Questo protocollo dimostra un metodo semplice, preciso e conveniente per determinare la rigidità della lente del mouse, utilizzando vetrini da applicare in sequenza crescente carichi di compressione sulla lente. Dati rappresentativi confermano che le lenti del mouse diventano più rigidi con l'età, comelenti umani. Questo metodo è altamente riproducibile e può potenzialmente essere scalata fino a meccanicamente le lenti di prova da animali più grandi.

Introduzione

The lens is a transparent and avascular organ in the anterior chamber of the eye that is responsible for fine focusing of light onto the retina. A clear basement membrane, called the lens capsule, surrounds a bulk of elongated fiber cells covered by an anterior monolayer of epithelial cells^1,2. Life-long growth of the lens depends on the continuous proliferation and differentiation of epithelial cells at the lens equator into new fiber cells that are added onto previous generations of fiber cells in a concentric manner². Over time, lens fiber cells undergo compaction, resulting in a rigid center in the middle of the lens called the nucleus¹. Accommodation, defined as a dioptric change in the optical power of the eye, occurs in humans when the ciliary muscles contract to deform the lens and allow a true increase in optical power to focus on near objects^3-5. In the unaccommodated eye, the lens is held in a relatively flattened state due to tension from zonular fibers. When the ciliary muscles contract, the tension on the lens is released, leading to decreased lens equatorial diameter and increased axial thickness. Age-related changes in the lens cause presbyopia, a progressive loss of lens accommodation, which leads to the need for reading glasses.

Several studies have linked presbyopia to age-related increase in the intrinsic stiffness of the lens^6-11. Stiffness is defined as the resistance of an elastic object to deform under applied load. A variety of methods have been used to examine stiffness of human lenses, including spin compression^12-14, actuator compression¹⁵, probe indentation¹⁶, dynamic mechanical analysis ^6,10 and bubble-based acoustic radiation force¹⁷. While mouse lenses do not accommodate or develop presbyopia, mouse models for lens pathologies are valuable tools because mice are less expensive than larger animals, well characterized genetically and undergo accelerated age-related changes due to rapid aging. A handful of studies have examined mouse lens stiffness with compression methods and demonstrated changes in lens stiffness due to aging or targeted genetic disruptions^18-21. Thus, mouse lenses are good models for studying age-related changes in lens stiffness.

This protocol describes a simple and inexpensive, yet precise and reproducible, compression method for determining mouse lens stiffness based on application of glass coverslips onto the lens in conjunction with photographing the lens through a dissection microscope and mirror. This method yields robust strain and morphometric data with an easily fabricated and assembled apparatus. The representative results confirm that mouse lenses increase in stiffness with age.

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Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le raccomandazioni della Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio dal National Institutes of Health e sotto un protocollo approvato dal Comitato Istituzionale cura e l'uso degli animali al The Scripps Research Institute.

1. Obiettivo dissezione

1. Euthanize topi in base alle raccomandazioni del National Institutes of Health "Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio" e approvati utilizzano protocolli istituzione animali.
2. Enucleate l'occhio da topo, utilizzando pinze curve. Premere il tessuto intorno l'occhio con le pinze per portare l'occhio dalla presa di corrente, e quindi cogliere l'occhio dalla presa con le pinze. Trasferire gli occhi di fresco 1x tampone fosfato salino (PBS) nel piatto dissezione.
3. Tagliare il nervo ottico più vicino al bulbo oculare possibile. Delicatamente e con attenzione inserire sottili pinzette direttamente nel bulbo oculare attraverso il foro di where il nervo ottico esce dal posteriore.
4. fare attenzione un'incisione con le forbici nel bulbo oculare dal posteriore al bordo della cornea. Lenti roditori occupano circa il 30% degli occhi. Fare queste incisioni attentamente, e non inserire le pinzette o forbici troppo in profondità nell'occhio per evitare di danneggiare l'obiettivo.
5. Tagliare lungo la giunzione tra la cornea e nella sclera almeno mezzo giro del bulbo oculare.
6. Premere delicatamente sulla cornea per rimuovere la lente dall'occhio attraverso l'apertura fatta in passi 1.4 e 1.5.
7. Utilizzare pinza sottile punta diritta per rimuovere attentamente qualsiasi detriti di grandi dimensioni che è ancora attaccato alla lente. Visivamente la lente di eventuali danni prima di procedere con le misurazioni di rigidità.

2. Rigidità Misure

1. Pesare almeno 10 vetrini dalla stessa scatola con una bilancia analitica. Trova il peso medio delle lamelle. Per coerenza, utilizzare la stessa confezione di lamelle per tutti gli esperimenti. Pre-bagnatoil coprioggetto e ad angolo retto specchio in 1x PBS a temperatura ambiente per almeno 2 ore prima di avviare esperimenti.
2. Riempire la camera di misura (vedi figura 1) con 65 - 75 ml di PBS 1x. La camera di misurazione è stata fatta di plexiglas da un negozio di macchina in-house, e divots nella camera sono state fatte da un trapano a colonna impostato per la profondità desiderata con una punta da trapano appropriata. Lenti rimangono trasparenti in 1x PBS a temperatura ambiente per la durata della prova meccanica.

Figura 1:. Rigidità camera di misura Una fotografia che mostra le dimensioni della camera di misura rigidità misura con una varietà di zolle di diverse profondità e forme. Le zolle rotonde che si trovano a 200 micron o 300 micron di profondità (punte di freccia di colore giallo) sono utilizzati per le misurazioni su lenti del mouse. Divots sono 2 mm di diametro e 13 ~-. 14 mm dal bordo della camera Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

3. Posizionare specchio ad angolo nella camera ad una distanza costante dal incavo che verrà utilizzato per tenere la lente. Assicurarsi che lo specchio non si sposta durante l'esperimento.
4. Trasferire lenti sezionati per camera di misura con attenzione con una pinza sequestro o pinze curve.
5. Prendete una vista dall'alto immagine della lente scaricato da sopra la sua testa. Prendete il mouse foto di lenti a 30X di ingrandimento con illuminazione da dissezione microscopio (in basso) e una sorgente di luce in fibra ottica sui lati destro e sinistro. Impostare l'alimentazione fibra ottica al 80% della massima intensità luminosa. Regolare la potenza di alimentazione sulla base di illuminazione ambientale, preferenze dell'utente e la qualità dell'immagine in base alle esigenze.
6. Dai vista laterale immagine della lente a vuoto, che può essere visto attraverso la rispecchio GHT angolo. Se la telecamera non è calibrato, scattare una foto del bordo specchio a fuoco. Il bordo dello specchio è lungo 5 mm, e questa misurazione può successivamente essere utilizzato per determinare il pixel / mm e servire come una barra di scala nelle immagini.
7. Posizionare lente nel divot, e confermare che l'obiettivo sia inserito in modo sicuro e dritto in incavo. Scatta una foto della lente prima di caricarla. L'obiettivo deve essere appoggiato nella zolla sulla sua anteriore o polo posteriore.
8. Mettere 1 coprioggetto delicatamente sulla lente. Attendere 2 minuti per consentire al creep, e prendere un altro vista laterale immagine della lente caricato.
9. Continuare ad aggiungere vetrini come al punto 2.8 e prendendo lato-vista le immagini dopo l'aggiunta di ogni vetrino come al punto 2.8 fino a quando vengono applicati un totale di 10 lamelle.
10. Rimuovere tutte le lamelle. Attendere 2 minuti, e prendere una vista laterale immagine della lente (all'interno e all'esterno del divot) dopo aver rimosso tutte le lamelle.

Misurazione 3. Obiettivo Nucleus

1. per determine la dimensione nucleo della lente, spostare l'obiettivo di un piatto pulito Petri riempita con PBS 1x.
2. decapsulate delicatamente la lente con pinza sottile diritte.
3. Spogliarci di cellule corticali fibra facendo rotolare la lente tra le dita guantate. Il nucleo della lente rimanente si sentirà come un marmo duro. Utilizzare questa procedura per isolare il nucleo sulle lenti per adulti a partire da 1 mese di età. Poiché il nucleo isolato è un corpo rigido, ulteriori prove meccaniche del nucleo lente non può essere eseguita utilizzando il metodo descritto.
4. Lavare delicatamente il nucleo della lente in 1x PBS nella scatola di Petri.
5. Posizionare il nucleo obiettivo posteriore nella camera di misura (non nel divot), e prendere una immagine del nucleo lente attraverso lo specchio ad angolo retto.

Figura 2:. A Lenti mouse compresso dal Coprioggetto (A) Schema e (B) fotografia della exl'installazione sperimentale che mostra un 2 mesi lente del mouse in una zolla di 200 micron di profondità nella camera di misura piena di PBS 1x. Uno specchio angolo retto e una fotocamera digitale montata su un microscopio dissezione stati usati per raccogliere le immagini della lente durante la compressione da coprioggetto. (C) Foto di viste sagittali di 2 mesi lente wild-type compressa in successione un numero crescente di vetrini fornito i dati grezzi per misurare i diametri assiali ed equatoriali e calcolando ceppi assiali ed equatoriali durante i test di compressione vetrino-based. Una riflessione della lente a volte può essere visto in i coprioggetti (più chiaramente visibile l'immagine del 1 vetrino in). Quando si effettuano misurazioni, ignorare il riflesso e misurare all'apice della lente. (D) Foto di vista sagittale del 2 mesi lente wild-type post-compressione e il nucleo della lente isolato. L'obiettivo post-compressione e nuclei isolati sono seduti al di fuori della incavo. Barre di scala, 1 mm. Questa cifra viene modificato da Gokhin, et al. PLoS ONE 2012 ^19. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Analisi 4. Immagine

1. Misurare i diametri equatoriale e assiali delle lenti prima del carico e dopo ogni fase di carico utilizzando ImageJ o software simili. Misurare il diametro di ogni nucleo lente. Il nucleo della lente è quasi sferica così una misura in qualsiasi orientamento sarà sufficiente ^19,21.
2. Correggere la lente assiale diametri aggiungendo la profondità incavo utilizzato. Nella camera di misura, incavo oscurata 200 micron (lenti 2 mesi di età topo) o 300 micron (lenti 4 mesi di età e 8 mesi di età mouse) dello spessore assiale della lente.
3. Calcolare il assiale e ceppi equatoriali dalle misurazioni del diametro della lente utilizzando l'equazione, ε = (d - d ₀₎ / d _0, dove ε è la deformazione, d è la assiale o ediametro Quatorial a un determinato carico, e d ₀ è il diametro assiale o equatoriale corrispondente al carico nullo.
4. Tracciare assiale e ceppi equatoriali come funzioni del carico imposto (in mg).
5. Tracciare assiale, equatoriale e diametri nucleari. Calcolare e tracciare le proporzioni obiettivo dividendo il diametro assiale dal diametro equatoriale.
6. Calcolare e tracciare il volume della lente utilizzando l'equazione, volume = 4/3 × π × R _e ² × R _A, dove r è il raggio _E e R equatoriale _A è il raggio assiale misurata dalla foto scattata nella fase 2.6. Questa equazione presuppone la lente è uno sferoide oblato (ellissoide) ^1,22.
7. Calcolare e tracciare il volume nucleare utilizzando l'equazione, volume = 4/3 × π × r _N ^3, dove r _N è il raggio del nucleo cristallino come misurata dalla foto scattata al passo 3.5. Questa equazione assume il I nucleo della lentesa sfera ^19,21.
8. Calcolare e tracciare la frazione nucleare come il rapporto tra il volume nucleare per il volume obiettivo.

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Risultati

La rigidità e dimensioni di 2, 4 e 8 mesi di età lenti di topo sono stati misurati. I topi sono stati tutti gli animali wild-type su un puro C57BL6 ceppo sfondo ottenuto dal Fondo Allevamento TSRI degli animali, e ogni obiettivo è stato caricato con da 1 a 10 lamelle. I ceppi assiali ed equatoriali sono stati calcolati in funzione del carico applicato misurando assiale e diametri equatoriale della lente dopo l'aggiunta di ciascun vetrino, quindi normalizzare ogni variazione di dia...

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Discussione

Ci sono diverse considerazioni importanti quando si utilizza questo metodo per misurare la rigidità della lente. Innanzitutto, i coprioggetti sono applicati alla lente con un angolo leggermente obliqua (8 - 8,5 °) rispetto al fondo della camera (θ). Questo si applica una piccola componente del carico equatoriale piuttosto che assialmente. Tuttavia, questo carico equatoriale è considerata trascurabile, perché il peccato θ ≈ 0.1 ^19. Se questo metodo è adattato per lenti più grandi, l'angolo delle ...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fine tip straight forceps	Fine Scientific Tools	11252-40
Microdissection scissors, straight edge	Fine Scientific Tools	15000-00
Curved forceps	Fine Scientific Tools	11272-40
Seizing forceps	Hammacher	HSC 702-93	Optional
Dissection dish	Fisher Scientific	12565154
60 mm Petri dish	Fisher Scientific	0875713A
1x phosphate buffered saline (PBS)	Life Technologies	14190
18 x 18 mm glass coverslips	Fisher Scientific	12-542A
Measurement chamber with divots to hold lenses			Custom-made (see Figure 1)
Right-angle mirror	Edmund Optics	45-591
Light source	Schott/Fostec	8375
Illuminated dissecting microscope	Olympus	SZX-ILLD100	With SZ-PT phototube
Digital camera	Nikon	Coolpix 990