Isolamento dei microrganismi del suolo con la tecnologia iChip

Riepilogo

La tecnica iChip si avvale di un dispositivo di isolamento in situ semplice ed economico che aumenta i tassi di scoperta di nuovi microrganismi dal suolo. Nuovi microrganismi possono essere utilizzati per ulteriori studi relativi al microbioma del suolo o alla scoperta di prodotti naturali, tra le altre applicazioni.

Abstract

La tecnica di isolamento iChip utilizza un dispositivo di isolamento in situ che aumenta la coltivabilità di microrganismi precedentemente non coltivabili. I microrganismi sono un'importante fonte di nuove sostanze chimiche e molecole potenzialmente bioattive. Tuttavia, solo l'1% dei microrganismi ambientali può essere coltivato con metodi di laboratorio convenzionali. Con l'aumento della resistenza antimicrobica, trovare nuovi farmaci per combattere infezioni e malattie è di primaria importanza, e un metodo fondamentale per trovare nuove molecole è la scoperta di nuovi microrganismi. Incubando colonie di microrganismi del suolo nei pozzetti di una piastra da 96 pozzetti, sigillata con una membrana semipermeabile e incubata sopra il suolo, i microbi sono in contatto con l'acqua e i fattori di crescita del suolo, consentendo l'isolamento di nuovi microbi in un ambiente di laboratorio. Dopo un periodo di addomesticamento in un iChip, i microrganismi possono potenzialmente essere subcoltivati su terreni convenzionali e utilizzati per ulteriori studi. Questo dispositivo è prezioso per la scoperta di molecole bioattive e la ricerca sul microbioma del suolo ed è stato utilizzato in precedenza in entrambe le applicazioni.

Introduzione

I batteri ambientali sono una ricca fonte di prodotti naturali (NP)¹. Questi metaboliti non sono vitali per la sopravvivenza dei microrganismi, ma sono invece prodotti per facilitare la loro colonizzazione superando gli altri microrganismi nel loro ambiente². L'evoluzione ha messo a punto le strutture chimiche e le attività delle NP, rendendole efficaci agenti antimicrobici. Un esempio di questo tipo è la daptomicina, un antibiotico approvato dalla FDA nel 2003³. Negli ultimi anni, la resistenza microbica è aumentata in termini di incidenza e gravità e nuovi farmaci come la daptomicina rappresentano trattamenti di ultima linea contro le infezioni che hanno sviluppato resistenza agli antibiotici più vecchi⁴. Lo sviluppo di nuovi antibiotici e altri farmaci è essenziale per mantenere curabili le infezioni e le malattie comuni.

Sebbene le NP siano spesso buone per i farmaci, l'industria farmaceutica si è rivolta a metodi sintetici per la scoperta di farmaci dopo l'età d'oro degli antibiotici negli anni '50 e '60⁵. Negli anni '70, gli stessi microrganismi e metaboliti antimicrobici continuavano ad essere reisolati ripetutamente, con la scoperta di sempre meno nuovi farmaci candidati ^1,6. Il microbioma del suolo contiene una grande diversità microbica, ma solo un piccolo numero di microrganismi può essere isolato in condizioni di laboratorio convenzionali. La stragrande maggioranza dei microrganismi del suolo rilevati dalla genomica non viene osservata quando coltivata con metodi di coltura convenzionali, il che ha portato a definire la questione "l'anomalia del grande conteggio delle piastre^"7. Questi microbi incoltivabili sono stati chiamati materia oscura microbica in quanto sono noti per esistere, ma non possono essere studiati in vitro fino a quando non possono essere isolati come colture pure. Questi microrganismi non coltivabili possono probabilmente produrre una grande quantità di farmaci candidati, il che è di grande importanza nell'era della resistenza microbica.

La tecnica iChip è un metodo che può essere utilizzato per aumentare il recupero di nuovi microrganismi dall'ambiente ^8,9. Questa tecnologia aiuta a simulare l'ambiente naturale dei batteri durante l'incubazione, aumentando così la coltivabilità di microrganismi che altrimenti non potrebbero sopravvivere alle condizioni di laboratorio convenzionali¹⁰. Gli iChip modificati sono già stati sviluppati e utilizzati per isolare microrganismi da molte fonti diverse, come il suolo, i sedimenti, gli ambienti marini e l'intestino degli animali 11,12,13,14,15,16. Forse il caso più impattante dell'uso di questa tecnologia è stato quello di NovoBiotic Pharmaceuticals, dove è^{stato scoperto un} nuovo batterio, l'Eleftheria terrae. È stato scoperto che questo microrganismo produce Teixobactina, un antibiotico di una nuova classe, che inibisce diverse specie batteriche resistenti pertinenti alla salute umana senza rilevare lo sviluppo di resistenza ^5,18. Questa è stata una scoperta di grande impatto in quanto la teixobactina è la prima nuova classe di antibiotici scoperta da decenni ed è un segno che questa tecnica è un percorso promettente per la scoperta di nuovi farmaci e il superamento dell'anomalia del grande numero di piastre¹⁹. In questo articolo, viene presentato un iChip modificato basato su una precedente pubblicazione di Berdy et al., ottimizzato per la facilità d'uso e la prevenzione della contaminazione⁹.

Protocollo

1. Preparazione dei terreni e sterilizzazione

1. Preparare e sterilizzare il terreno di coltura con sali minimi di succinato (SMS), che consiste in 0,1 g di fecola di patate, 1 g di casamino acidi, 0,125 g di caseina digestato e 15 g di agar batteriologico o tecnico in 1 L di acqua.
2. Sterilizzare in autoclave il terreno e 100 ml di acqua di grado molecolare utilizzando un ciclo liquido di 20 minuti, 121 °C.
   NOTA: Assicurarsi che tutti gli altri elementi che entreranno in contatto con la miscela di cellule di agar siano acquistati sterili, compresi i puntali delle pipette e le provette da centrifuga, altrimenti sterilizzarli in autoclave.

2. Costruzione iChip modificata

1. Rimuovere il fondo dei pozzetti in quattro piastre da 96 pozzetti utilizzando un punzone per agar da 5 mm.
2. Tagliare membrane in policarbonato da 0,05 μm in rettangoli di 7,6 cm x 11 cm, o uguali alle dimensioni del fondo della piastra a 96 pozzetti.
3. Utilizzando un sigillante siliconico, far aderire membrane in policarbonato da 0,05 μm sul fondo delle piastre a 96 pozzetti, assicurandosi che l'adesivo sigilli i pozzetti, ma non copra completamente le aperture dei pozzetti. Lasciare asciugare per almeno 24 ore o seguendo le istruzioni riportate sull'adesivo.
   NOTA: Il sigillante deve essere impermeabile, atossico e 100% silicone. La maggior parte dei sigillanti per acquari funzionerà bene.

3. Preparazione delle sospensioni cellulari

1. Etichettare quattro provette da centrifuga da 15 mL A-D e quattro provette da centrifuga da 50 mL E-H e aggiungere 4,5 mL di acqua sterile a ciascuna.
2. Misurare 1 g di terreno in una provetta da centrifuga da 50 ml, aggiungere 10 ml di acqua sterile e agitare per 10 minuti.
3. Lasciare riposare la sospensione del terreno per 10 min.
4. Pipettare 0,5 mL di surnatante contenente cellule dal terreno nella provetta A e mescolare accuratamente.
5. Aggiungere 0,5 mL della sospensione cellulare nella provetta A alla provetta B e mescolare accuratamente. Trasferire 0,5 mL di soluzione B nella provetta C e mescolare accuratamente. Ripetere l'operazione per tutte le provette da centrifuga rimanenti, completando una serie di diluizioni di 10 volte nelle otto provette da centrifuga.
6. Rimuovere 0,5 mL dalla provetta H per avere un volume uguale in tutte le provette.
   NOTA: Queste concentrazioni sono ottimizzate per i terreni locali. Quando si tenta questa procedura per la prima volta, eseguire una gamma più ampia di diluizioni per trovare la concentrazione del campione appropriata.

4. Inoculazione di iChip modificata

1. Immergere completamente gli iChips in etanolo al 95% per almeno 15 minuti.
2. Togliete le piastre dall'etanolo e mettetele su un tovagliolo di carta sterile. Lasciando evaporare l'etanolo, accendere lo sterilizzatore UV nella cappa a flusso laminare per 15 minuti per sterilizzarlo ulteriormente.
3. Pipettare 360 μl di terreno SMS sterile nella prima colonna della piastra per fungere da pozzetti di controllo.
4. Aggiungere 45 mL di SMS raffreddato a 50 °C alla sospensione cellulare nella provetta E e mescolare accuratamente per combinare la sospensione cellulare e l'agar.
5. Pipettare 360 μl della miscela di cellule di agar della fase 4.4 in tutti gli altri pozzetti della piastra a 96 pozzetti.
   NOTA: Si consiglia una pipetta multicanale poiché l'agar si solidifica rapidamente. Si sconsiglia di riscaldare la miscela di cellule di agar una volta miscelata a causa del rischio di uccidere i microrganismi.
6. Una volta che il terreno è solidificato, sigillare la parte superiore delle piastre con un coperchio per piastre PCR.
7. Ripetere i passaggi da 3.3 a 3.6 con le provette F-H per riempire un totale di quattro iChip con differenze di concentrazione di dieci volte.
   NOTA: Il supporto può essere cotto nel microonde per 30 s con un tappo allentato quando necessario o conservato in un bagno di acqua calda a 60 °C tra le piastre per garantire che rimanga fuso per ciascuna.

5. Incubazione

1. Posizionare le piastre in una scatola contenente circa un pollice del terreno utilizzato nel passaggio 3.2, con la membrana rivolta verso il basso e posizionare il coperchio.
2. Incubare le piastre nel contenitore coperto, in un luogo buio a 25 °C.
   NOTA: Dopo una settimana, esaminare il contenuto degli iChip modificati per assicurarsi che non si siano verificate contaminazioni durante la configurazione. La contaminazione è indicata dalla crescita eccessiva di uno o pochi microrganismi in tutti i pozzetti di una piastra.
3. Dopo 6 settimane, esamina gli iChip. Utilizzare le piastre contenenti la crescita in meno del 25% dei pozzetti per l'isolamento delle colonie.

6. Isolamento delle colonie

1. Sciacquare gli iChip modificati 3 volte con acqua sterile per rimuovere tutte le particelle di terreno.
2. Pulire la parte superiore e i lati della piastra con etanolo al 95%, evitando il lato con la membrana semipermeabile.
3. Usando una lama sterile, tagliare il coperchio della piastra attorno a un pozzetto contenente una colonia.
4. Utilizzando uno strumento sterile per striature, forare la colonia e striare su agar SMS in piastre da 100 x 15 mm utilizzando il metodo a quattro quadranti.
5. Ripeti per tutte le altre colonie negli iChip che stanno crescendo una colonia per pozzetto.
   NOTA: Per le colonie minuscole, la piastra può essere riposizionata sul terreno e incubata fino a quando non è abbastanza grande da poter essere sottocoltivata, purché il coperchio della piastra non sia stato rimosso intorno al pozzetto.
6. Incubare le piastre SMS a 25 °C e monitorare la crescita.
7. Esamina le colonie per assicurarti che le colture axeniche siano state isolate.

7. Identificazione dei microrganismi

1. Sequenziare i genomi degli isolati recuperati²⁰.
2. Valutare i genomi utilizzando JSpeciesWS o un'altra piattaforma di identificazione basata sul genoma per determinare il grado di somiglianza di ciascun isolato con microrganismi noti in GenomesDB.
3. Classificare gli isolati al di sotto delle soglie accettate dalla comunità per l'identificazione delle specie come putativamente nuovi.

Risultati

Una panoramica visiva del protocollo è mostrata nella Figura 1. Un esperimento di iChip modificato di successo ha come risultato che almeno una piastra contiene una crescita in meno del 25% dei pozzetti, senza che si verifichi alcuna crescita nei pozzetti di controllo. Questo numero di pozzi in crescita garantisce generalmente che le singole colonie siano isolate nei pozzi. Inoltre, il numero di colonie, o il numero di pozzetti contenenti colonie, dovrebbe diminuire di dieci volte con ogni successiva piastra preparata dalla serie di diluizioni. I risultati rappresentativi sono mostrati nella Figura 2. dove le piastre 7 e 8 hanno successo iChip in quanto contengono crescita in meno del 25% dei pozzetti e la percentuale di pozzetti contenenti colonie diminuisce con ciascuna piastra, come mostrato nella Tabella 1. Se tutte le piastre in una prova contengono più di una colonia per pozzetto o nessuna colonia in nessun pozzetto, ciò costituisce un risultato negativo.

Figura 1: Panoramica schematica per l'utilizzo di un iChip modificato per la coltura di microbi del suolo. (A,B) Costruzione della piastra (Passaggio 2). (C) Preparazione dell'inoculo (Fase 3). (D,E) Configurazione dell'iChip (Passaggio 4). (F) Incubazione dell'iChip (Fase 5). (G-I) Trasferimento degli isolati in terreni convenzionali (Fase 6). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Ichip	Concentrazione del suolo in sospensione di agar	Pozzi con colonie	Unità formanti colonie
E	5,0 x 10-6 g/mL	Tutto	Troppi per essere contati
F	5,0 x 10-7 g/mL	Tutto	Troppi per essere contati
G	5,0 x 10-8 g/mL	22	22
H	5,0 x 10-9 g/mL	6	6

Tabella 1: Dati rappresentativi di un esperimento iChip di successo in cui il numero di pozzetti contenenti colonie diminuisce ad ogni diluizione in serie.

Figura 2: Risultati esemplificativi di due iChip modificati riusciti. Gli iChip provenivano dallo stesso esperimento in cui (A) la piastra preparata dalla miscela di cellule-agar G contiene 22 colonie e (B) la piastra preparata dalla miscela cellule-agar H contiene sei colonie, coerenti con la differenza di diluizione di 10 volte tra le miscele. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Si possono visualizzare le colonie ad occhio nudo o al microscopio, come mostrato nella Figura 3A-G. Le colonie possono crescere sulla superficie dell'agar, come si vede nella Figura 3B o incorporate nell'agar, come la colonia nella Figura 3F. Ci possono essere casi in cui ci sono due colonie nello stesso pozzetto in un iChip modificato riuscito, come nella Figura 3G. In alcuni casi, le colonie sono abbastanza distanti tra loro da poter essere forate con un ago separatamente e sottocoltivate; tuttavia, è improbabile che quelli nella Figura 3G possano essere facilmente coltivati come microrganismi axenici. Esempi di colonie trasferite dall'iChip su supporti SMS convenzionali sono mostrati nella Figura 4.

Figura 3: Vista microscopica rappresentativa delle colonie che crescono in un iChip dopo 6 settimane di incubazione. (A-F) Si osservano singole colonie, che dovrebbero essere sottocoltivate, e in (G) si osservano due colonie in stretta vicinanza, che sono difficili da ottenere come colture axeniche. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Risultato rappresentativo di un batterio isolato dall'iChip modificato una volta cresciuto su una piastra di agar SMS. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Anche la capacità di isolare le colonie dall'iChip modificato su piastre di agar convenzionali determina il successo dell'esperimento. Non tutte le colonie che crescono nell'iChip modificato sopravviveranno al trasferimento su piastre convenzionali. In un iChip, le colonie sono esposte a fattori di crescita e nutrienti del suolo, aumentando la loro coltivabilità. Per alcuni microrganismi, un periodo di addomesticamento non è sufficiente per renderli coltivabili in condizioni convenzionali. Il tasso di recupero delle colonie da un iChip a piastre varia da esperimento a esperimento, ma alcune dovrebbero crescere in piastre poiché questo metodo coltiverà anche microrganismi facilmente coltivabili. Ad esempio, gli iChip modificati nella Figura 2 contenevano 28 colonie in totale e il numero di colonie che sono cresciute su piastre di agar dopo la sottocoltura è stato di 16, mentre 12 non sono sopravvissute al trasferimento. Gli isolati possono essere identificati e utilizzati per ulteriori studi una volta coltivati su piastre di agar di dimensioni standard, come mostrato nella Figura 4.

Un esperimento iChip modificato di successo dovrebbe portare all'isolamento di microrganismi che differiscono dai microrganismi noti a livello di specie. Il grado di somiglianza di ciascun isolato con microrganismi noti si trova confrontando il DNA isolato con i genomi di microrganismi noti. I punteggi tetra Z dei microrganismi imparentati più vicini a ciascun isolato descrivono la percentuale di somiglianza. La Figura 5 mostra che dei dodici batteri isolati, quattro erano specie nuove o superiori, due erano probabilmente nuovi ceppi e sei erano microrganismi noti. Il recupero di diverse nuove specie o ceppi è coerente con gli esperimenti iChip precedentemente pubblicati, indicando che questa costruzione iChip modificata non impedisce l'aumento del recupero di nuove specie¹¹.

Figura 5: Il livello di classificazione tassonomica degli isolati recuperati da un esperimento iChip. La percentuale di somiglianza è stata determinata in base ai punteggi tetra Z, che descrivono la somiglianza degli isolati con i batteri noti, dove la somiglianza del >99,9% indica una corrispondenza di specie, la somiglianza del 98,9%-99,9% indica una possibile nuova specie e la somiglianza del <98,9% indica una nuova specie o superiore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Numerosi metodi, come l'estrazione del genoma e l'esame di percorsi biosintetici silenti, hanno facilitato la scoperta di nuove sostanze chimiche bioattive negli ultimi anni^21,22. Tuttavia, le NP scoperte utilizzando tali metodi mostrano spesso un'elevata somiglianza strutturale con composti noti. Ottenere l'accesso a microrganismi precedentemente non coltivati sbloccherà una maggiore diversità chimica e NP con nuove modalità d'azione che possono aiutare meglio a combattere la resistenza microbica. La tecnica di isolamento iChip ha dimostrato di aumentare la coltivabilità di nuovi microrganismi, che possono essere utilizzati per costruire librerie di microrganismi per la scoperta di nuove NP.

La prima concettualizzazione di un iChip è stata pubblicata nel 2002, che consisteva in singoli anelli metallici contenenti una miscela di celle di agar sigillate con membrane semipermeabili e incubate in situ²³. Successivamente è stato iterato nel 2010 per contenere un piccolo chip con molti pozzetti¹¹, seguito dallo sviluppo di un iChip economico costruito con materiali di laboratorio comuni in un'influente pubblicazione di Nature Protocols nel 2017⁹. In questa pubblicazione sono state apportate diverse modifiche al protocollo Nature per migliorarne la praticità e la facilità d'uso. Il protocollo Nature prevede l'incollaggio di una membrana semipermeabile su entrambi i lati di un chip rispetto a questo metodo, che utilizza una copertura adesiva su un lato. Possono sorgere problemi quando si utilizza la colla siliconica per fissare la membrana dopo che l'iChip è stato caricato. Per quanto ne sappiamo, tutti gli adesivi siliconici non tossici emettono acido acetico durante la presa, il che può influire sulla vitalità cellulare²⁴. Il protocollo descritto in questo video riduce anche significativamente la quantità di manipolazione necessaria dopo l'inoculazione utilizzando il coperchio della piastra PCR per sigillare la piastra riempita, garantendo ulteriormente la sterilità e riducendo il tempo di configurazione. Sulla base dell'identificazione di più nuovi isolati da questo esperimento, l'uso di una sola membrana semipermeabile inibisce l'aumento dei tassi di scoperta di nuovi organismi che è stato riportato per gli iChip costruiti con due membrane semipermeabili. Tuttavia, sarebbero necessari ulteriori esperimenti con un campione di dimensioni maggiori per quantificare l'impatto.

Un'altra modifica del metodo consiste nel sottocoltivare solo gli iChip modificati che contengono una crescita in meno del 25% dei pozzi. Se le colonie crescono nella maggior parte dei pozzetti di una piastra, è probabile che ci siano alcuni pozzetti che contengono più microrganismi, anche se non facilmente visibili. Durante lo sviluppo del metodo si è scoperto che era in gran parte impossibile ottenere colture axeniche quando si subcoltivava da pozzi contenenti più di una colonia. L'isolamento di colture non assoniche presenta problemi significativi a valle in termini di saggi di bioattività e identificazione. Pertanto, per semplicità, si consiglia di sottocoltivare solo gli iChip modificati con colonie che crescono in una parte dei pozzetti.

Il problema più significativo che può sorgere con i metodi iChip è la contaminazione di pozzetti o interi iChip con altri microrganismi. La contaminazione è indicata da colonie che crescono nei pozzetti di controllo o dallo stesso microrganismo che cresce in diversi pozzetti o in un'intera area dell'iChip modificato. La fonte di contaminazione potrebbe essere dovuta a una sterilizzazione inadeguata dei materiali durante la configurazione o a una tecnica asettica impropria. In tali casi, assicurarsi che tutti i materiali utilizzati siano sterilizzati in autoclave o etanolo come indicato nel metodo e assicurarsi che non si verifichi alcun contatto tra gli articoli non sterili e l'iChip modificato diverso dalla miscela di agar-cellule. Se si osserva una crescita eccessiva di un singolo microrganismo nella parte inferiore o superiore di più pozzetti iChip modificati, è molto probabilmente il risultato di una tenuta incompleta tra i pozzetti e la membrana. In questo caso, assicurarsi che l'adesivo utilizzato sia silicone al 100%, che non si degrada in etanolo, e assicurarsi che la membrana semipermeabile e il coperchio della piastra PCR siano completamente sigillati attorno a ciascun pozzetto durante la costruzione.

La serie di diluizioni utilizzata nell'attuale protocollo dovrebbe fornire una diluizione adeguata per la maggior parte dei tipi di terreno con un periodo di stoccaggio inferiore a una settimana, in quanto include un intervallo di diluizioni di mille volte. Tuttavia, ci possono essere variazioni significative nel numero di microrganismi tra i tipi di suolo. Se i pozzetti di controllo non contengono crescita ma crescono più colonie in ciascun pozzetto di tutti e quattro gli iChip modificati, le concentrazioni cellulari utilizzate non erano sufficientemente basse. La serie di diluizioni deve essere modificata per raggiungere concentrazioni cellulari più basse nelle miscele di terreni cellulari utilizzate per impostare gli iChip modificati. Analogamente, se non si osserva alcuna crescita in nessuna di queste piastre, le concentrazioni utilizzate nelle miscele di terreni cellulari devono essere aumentate. In alternativa, è possibile che la temperatura del mezzo utilizzato fosse troppo alta per la sopravvivenza dei microrganismi. In tal caso, il terreno deve essere lasciato raffreddare il più possibile senza solidificarsi prima di essere aggiunto alla sospensione cellulare diluita.

La tecnologia è un importante passo avanti verso il superamento dell'anomalia del grande numero di targhe. Tuttavia, è ancora limitato dall'inadeguatezza delle tecniche di coltura convenzionali, come indicato dal numero di microrganismi che non sopravvivono al trasferimento dall'iChip modificato alle piastre di agar convenzionali. Pubblicazioni precedenti hanno riportato che più cicli di sottocoltura e incubazione in iChips aumentano ulteriormente la coltivabilità dei microrganismi. Il tempo di addomesticamento prolungato e l'esposizione ai fattori di crescita del suolo durante l'assunzione di agar nell'iChip aumentano le possibilità di crescita di una colonia solo con agar. Tuttavia, non è stato riportato che questo approccio produca una maggiore probabilità di nuovi microrganismi rispetto a una singola incubazione di iChip ^25,26.

Molte altre tattiche sono in fase di esplorazione e modifica per aumentare la coltivabilità di nuovi microrganismi. Ad esempio, è stato proposto di realizzare un intero dispositivo iChip con un materiale semipermeabile per facilitare la co-coltura di microrganismi nei pozzetti vicini²⁷. Detto questo, un vantaggio della costruzione delineato in questa pubblicazione è il suo basso costo, con il costo di costruzione di una piastra pari a circa $ 12 ($ 4 per piastra da 96 pozzetti, $ 8 per membrana, $ 2 per copertura PCR). Inoltre, la sua costruzione semplice lo rende uno strumento semplice se utilizzato come descritto e offre molte possibilità di personalizzazione. Sebbene questo protocollo utilizzi un mezzo selettivo per i batteri, la configurazione sperimentale può teoricamente essere regolata per mirare a una popolazione microbica desiderata modificando il mezzo utilizzato, ad esempio utilizzando terreni che sopprimono i batteri per colpire i funghi o agar a basso contenuto di nutrienti per i microrganismi sporulanti.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1-20 µL pipette tips	VWR	76322-158	Pack of 768
0.2 mL PCR tubes	ThermoFisher Scientific	AB0337	Case of 1000
0.5-5 mL single channel pipette	VWR	CA11020-004
1 L glass bottle	Millipore Sigma	CLS13951L	Must be autoclaveable.
100 x 15 mm Petri plates	VWR	25384-342	Case of 500
100% Silicone sealant	Marineland	31003
1000 µL multichannel pipette tips	ThermoFisher Scientific	9401113	Case of 960
100-1000 µL pipette tips	VWR	76322-164	Pack of 768
100-1000 µL single channel pipette	VWR	76169-240
100-1200 µL multichannel pippette	ThermoFisher Scientific	46300800	Must have 360 µL volume capacity.
1-10 µL single channel pipette	VWR	76169-232
1-5 mL pipette tips	VWR	CA11020-008	Pack of 500
15 mL sterile centrifuge tubes	VWR	CA21008-918	Case of 500
16s rRNA-F primer (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG) – 10mM	Integrated DNA Technologies	51-01-19-06	10 µg
16s rRNA-R primer (ACGGCTACCTTGTTACGACTT) – 10mM	Integrated DNA Technologies	51-01-19-07	10 µg
4 mm cork borer	VWR	470121-860
50 mL sterile centrifuge tubes	VWR	CA21008-940	Case of 500
95% ethanol	Thermo Fisher Scientific	A412-500	500 mL
96-well plate	VWR	10062-900	Case of 100
Autoclave	Cole-Parmer	UZ-01850-34	8 L, 115 VAC
Bacteriological agar	ThermoFisher Scientific	443570010	1 kg
bin	Thomas Scientific	1216H91	5 bins per pack
Casamino acids	ThermoFisher Scientific	223120	500 g
Casein digest	ThermoFisher Scientific	211610	500 g
Electrofluoresis grade agarose	Thermo Fisher Scientific	J66501.30	250 g
iBright FL1500 Imaging System	ThermoFisher Scientific	A44115
Laminar flow hood	CleanTech	1000-6-A
Minion Nanopore Sequencer	Oxford Nanopore Technologies	MinIon Mk1C
NanoDrop One/One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	ThermoFisher Scientific	ND-ONE-W
Nuclease Free Water	Thermo Fisher Scientific	AM9937	10 x 50 mL
Nucleobond HMW DNA kit	Takara	740160.2
Paper towel	VWR	89402-824
Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix	Thermo Fisher Scientific	F566L	500 Reactions
Potato starch	ThermoFisher Scientific	419690025	2.5 kg
QIAGEN CLC Genomics Workbench Software or similar	Qiagen
Rapid Barcoding 24 Kit	Oxford Nanopore Technologies	SQK-RBK114.24
SimpliAmp thermal cycler	Applied Biosystems	A24811
Sterile Inoculation loops with needle	VVWR	76534-512	Case of 1000
Sterile surgical blade	VWR	76457-444
SYBR Safe, or simmilar	ThermoFisher Scientific	S33101
UltraPure Agarose	ThermoFisher Scientific	16500-500
Vortex	VWR	76549-928	Must accomadate 15 and 50 mL centrifuge tubes
VWR Stereo Zoom Trinocular Microscope	VWR	89404-476
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes	Millipore Sigma	WHA113502	L x W 8 in. x 10 in., pore size 0.03 μm