Iniziare modificando chimicamente le frazioni proteiche raggruppate attraverso la metilazione riduttiva. Per fare ciò, prendi la proteina purificata e aggiungi 20 millimolari di dimetilammina borano, seguiti da 40 millimolari di formaldeide. Incubare la miscela in agitatori oscillatori per due ore a quattro gradi Celsius.
Quindi, aggiungere altri 10 millimolari di dimetilammina borano alla miscela. Successivamente, incubare la miscela per una notte per 12-18 ore a quattro gradi Celsius. Estinguere la reazione aggiungendo 100 millimolari di cloruro tris con pH di 7,5.
Utilizzare il tampone di lavaggio e il tampone di eluizione appropriati per caricare la proteina metilata su una colonna di nichel-NTA. Innanzitutto, lavare la colonna di nichel-NTA da due millilitri con 10 volumi di colonna di tampone di lavaggio. E poi, eluire la proteina con il tampone di eluizione.
Dopo l'eluizione, far passare l'eluato proteico attraverso una colonna di desalinizzazione PD-10, pre-equilibrata con l'apposito tampone. Aggiungere il colesterolo preparato in isopropanolo o etanolo alla proteina dissalata e incubare la miscela per una notte a quattro gradi Celsius. La mattina successiva, ultracentrifugare la miscela a 150.000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius.
Aggiungere il surnatante raccolto a un concentratore centrifugo con un cutoff di 100 kilodalton e concentrare il surnatante a una concentrazione finale di 30-50 milligrammi per millilitro. Ancora una volta, centrifugare la proteina concentrata utilizzando una centrifuga refrigerata da banco ad alta velocità e rimuovere il pellet. Posizionare il surnatante raccolto sul ghiaccio a quattro gradi Celsius prima di procedere all'impostazione della cristallizzazione.
Le proteine alchilate conservate a quattro gradi Celsius sono state analizzate mediante cromatografia analitica di filtrazione su gel nel corso di un mese. E ha mostrato una leggera perdita di proteine dopo una settimana.
