Preparazione e riprogrammazione di lentivirus Trasduzione per cellule di adenocarcinoma duttale pancreatico

1 2 Per iniziare, vedere le cellule HEK 293T3 24 ore prima della trasfezione 4 in un piatto di 15 centimetri contenente GMEN. 5 Incubare le cellule a 37 gradi Celsius 6 e al 5% di anidride carbonica 7 fino a raggiungere il 40-50% di confluenza. 8 Etichettare tre provette di plastica da 15 millilitri 9 con il nome appropriato del lentivirus.

10 Aggiungere 1,710 millilitri di terreno sierico ridotto 11 e 90 microlitri di reagente di trasfezione in ciascuna provetta. 12 Mescolare il contenuto agitando 13 prima di incubare le provette a temperatura ambiente. 14 Dopo cinque minuti, aggiungere la miscela vettoriale di imballaggio 15 al mezzo di trasfezione e al vortice.

16 Quindi aggiungere 7,5 microgrammi di vettore di riprogrammazione 17 e il controllo pWPT-GFP 18 alla rispettiva miscela di trasfezione. 19 Agitare le provette per due secondi 20 prima di incubarle per 15 minuti a temperatura ambiente. 21 Per trasfettare le cellule 293T con ciascun lentivirus, 22 goccia a goccia, aggiungere una miscela di DNA di trasfezione nel piatto.

23 Incubare le cellule trasfettate a 37 gradi Celsius 24 e 5% di anidride carbonica. 25 Dopo 14-16 ore, 26 sostituire il terreno con 30 millilitri 27 di terreno 293T fresco 28 e continuare l'incubazione per 60-72 ore. 29 Osservare le celle ogni giorno 30 e controllare l'efficienza della trasfezione.

31 Successivamente, trasferire la coltura di trasfezione virale 32 in provette da 15 millilitri 33 e centrifugare a 1.932 G per 10 minuti 34 a quattro gradi Celsius. 35 Filtrare il surnatante lentivirale 36 utilizzando un filtro a siringa da 0,45 micron 37 in una nuova provetta da 50 millilitri. 38 Un giorno prima della trasduzione del lentivirus, 39 preparare due pozzetti di una piastra a 6 pozzetti 40 contenente 100.000 cellule PDAC per pozzetto.

41 Preparare due provette da 15 millilitri 42 con due millilitri di terreno PDAC preriscaldato. 43 Nella prima provetta, 44 aggiungere 12 millilitri di lentivirus riprogrammante. 45 Quindi aggiungere 12 microlitri di polibrene 46 e mescolare pipettando.

47 Al secondo tubo, 48 aggiungere due microlitri di polibrene. 49 Ora rimuovere con cura il terreno da ciascun pozzetto 50 di una piastra a 6 pozzetti 51 e lavare una volta con PBS a temperatura ambiente. 52 Aggiungere il mezzo di infezione di riprogrammazione 53 dalla prima provetta al primo pozzetto.

54 Aggiungere il composto dal tubo due al secondo pozzetto. 55 Incubare le cellule per una notte a 37 gradi Celsius 56 con il 5% di anidride carbonica e il 5% di ossigeno. 57 Il giorno successivo, sostituire il terreno 58 da entrambi i pozzetti con il terreno PDAC 59 fresco e continuare l'incubazione 60 per un massimo di 48 ore, come dimostrato.