Preparazione di cellule feeder iMEF e trasduzione di riprogrammazione per cellule staminali pluripotenti indotte

1 Per iniziare, rivestire la piastra a 6 pozzetti2 con due millilitri di soluzione di gelatina allo 0,2% per pozzetto. 3 Incubare la piastra a 37 gradi Celsius 4 e al 5% di anidride carbonica per 30 minuti. 5 Quindi, aggiungere goccia a goccia gli iMEF in una provetta da 15 millilitri 6 contenente 10 millilitri 7 di terreno di fibroblasti umani preriscaldato, 8 e mescolare capovolgendo delicatamente la provetta.

9 Centrifugare la sospensione cellulare a 309 G per tre minuti. 10 E rimuovere il surnatante prima di risospendere il pellet 11 in 12 millilitri di terreno di fibroblasti umani. 12 Inserire due millilitri della sospensione cellulare 13 in ciascun pozzetto della piastra a sei pozzetti rivestita di gelatina.

14 E incubare per una notte a 37 gradi Celsius 15 e 5% di anidride carbonica. 16 Scartare il terreno dal PDAC infetto da lentivirus 17 e non infetto e lavare le cellule due volte con PBS. 18 Quindi aggiungere 500 microlitri di tripsina per dissociare le cellule.

19 E incubare a 37 gradi Celsius 20 con il 5% di anidride carbonica e il 5% di ossigeno 21 per 15 minuti. 22 Centrifugare la sospensione cellulare a 300 G per cinque minuti. 23 E risospendere il pellet in un millilitro di terreno PDAC.

24 Lavare la piastra iMEF con un mezzo PDAC. 25 Quindi aggiungere 50.000 cellule PDAC infettate da lentivirus 26 per pozzetto in cinque pozzetti della piastra iMEF e incubare durante la notte 27 come dimostrato in precedenza. 28 Dopo aver preparato il terreno di riprogrammazione, 29 aggiungere 100 microlitri di fattore di crescita basico dei fibroblasti da 30 a 100 millilitri di terreno di riprogrammazione.

31 Il giorno successivo, lavare due volte le cellule che crescono sugli alimentatori iMEF 32 con mezzi di riprogrammazione preriscaldati. 33 Quindi aggiungere due millilitri di terreno in ciascun pozzetto, 34 e incubare per una notte a 37 gradi Celsius 35 con il 5% di anidride carbonica e il 3% di ossigeno. 36 Dopo aver superato il pool IPSC cinque volte, 37 osservano le colonie robuste 38 mantenendo una morfologia simile all'ESC.

39 Il PDAC, BxPc3, 40 H6c7 e il fibroblasto umano 41 hanno mostrato diversi giorni di riprogrammazione 42 per formare una morfologia matura simile all'ESC. Sono state stabilite 43 linee di IPSC clonali, 44 da ogni riprogrammazione di PDAC, 45 BxPc3, H6c7, 46 e cellule di fibroblasti umani. 47 Tutte le linee IPSC stabilite hanno colorato positivamente 48 per TRA-160, confermando la loro riprogrammazione in pluripotenza.