Dopo aver coltivato le cellule endoteliali nella piastra a 96 pozzetti, rimuoverla dall'incubatrice e confermare la confluenza utilizzando un microscopio invertito. Getta la piastra in un lavandino per rimuovere l'intero supporto e tampona la parte superiore della piastra con un tovagliolo di carta. Aggiungere il tampone per il saggio HBSS HEPES più la soluzione di probenecid a un serbatoio di solvente per pipette multicanale da 50 millilitri.
Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 100 microlitri di tampone per il saggio a ciascun pozzetto e lasciare riposare le cellule per cinque minuti. Quindi, muovere la piastra per rimuovere il tampone di analisi. Aggiungi il tampone di download a un serbatoio di solvente per pipette multicanale separato da 50 millilitri.
Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 50 microlitri di tampone di caricamento del colorante a ciascun pozzetto della piastra del saggio. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 45 minuti. Dopo l'incubazione, osservare la piastra al microscopio a fluorescenza per confermare l'assorbimento del colorante.
Muovi la piastra per rimuovere la soluzione colorante. Lavare le cellule due volte con 50 microlitri del tampone del saggio HBSS HEPES più la soluzione di probenecid in ciascun pozzetto. Muovere la piastra per rimuovere il tampone di analisi.
Aggiungere 92 microlitri di tampone per il saggio HBSS HEPES a ciascun pozzetto e, di nuovo, visualizzare le cellule con un microscopio a fluorescenza per assicurarsi che il colorante in eccesso sia stato completamente rimosso e che le cellule rimangano aderenti. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere due microlitri di soluzioni antagoniste e il veicolo nei pozzetti appropriati. Dopo aver acceso il lettore di piastre, impostare la temperatura a 37 gradi Celsius e incubare la piastra per 15 minuti.
Misurare la fluorescenza di fondo nelle colonne uno e due, eseguendo cinque scansioni per pozzetto. Espellere la piastra dal lettore di piastre, quindi da una striscia PCR da 8 provette, aggiungere rapidamente sei microlitri di soluzione agonista utilizzando una pipetta multicanale a ciascun pozzetto nelle colonne uno e due. Misurare la variazione della fluorescenza quando si verifica la mobilizzazione del calcio nelle cellule.
Esegui 20 scansioni di ogni pozzetto. Il test di mobilizzazione del calcio con cellule endoteliali ha dimostrato che i pozzetti di controllo positivi senza antagonisti hanno mostrato un rapido aumento della fluorescenza. I pozzetti con alte concentrazioni di antagonisti hanno mostrato una variazione minima della fluorescenza, simile ai pozzetti di controllo negativo senza agonista.
