Questo lavoro è stato sostenuto da fondi da American Heart Association (AM), US Department of Defense (BC074986), e Boston Children Hospital Facoltà Career Development Fellowship (TM, AM). Gli autori ringraziano Amanda Jiang e Jiang Elisabeth per l&#39;assistenza tecnica.

NOTA: Lo studio in vivo degli animali in stato effettuato in stretta conformità con le raccomandazioni della Guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health. Il protocollo è stato esaminato e approvato dalla cura degli animali e uso Comitato di Hospital di Boston per bambini (numeri di protocollo: 13-10-2526R, 14-02-2568R). Tutti i farmaci utilizzati in questo protocollo sono di qualità farmaceutica e questi farmaci sono preparati in condizioni sterili. 1. fibrina Gel Preparazione <ol><li> Preparare gel di fibrina che contiene VEGF e bFGF. <ol><li> Scongelare soluzioni stock di fibrinogeno e trombina che sono immagazzinate a -80 ° C a temperatura ambiente (25 ° C). </li><li> Aggiungere trombina (concentrazione finale: 2,5 U / ml), CaCl 2 (concentrazione finale: 45 mM), VEGF (concentrazione finale: 0-100 ng / ml) e bFGF (concentrazione finale: 0-100 ng / ml) al fibrinogeno soluzione (concentrazione finale: 12,5 mg / ml in 0,9% sodium soluzione di cloruro 43-45) in una provetta da 1,5 ml. </li><li> Mescolare delicatamente pipettando. </li><li> Pipettare delicatamente 200 microlitri della miscela su un piatto di plastica sterile in modo goccia a goccia con punta p200 pipetta. </li><li> Incubare le gocce a 37 ° C per 30-60 min fino a che solidificano. NOTA: Il gel solidificato può essere mantenuto nel piatto di plastica sigillata a temperatura ambiente (25 ° C) per diverse ore prima dell&#39;impianto (Figura 1a). </li></ol></li><li> Tagliare il gel di fibrina in circa 3 x 3 x 3 millimetri cubi utilizzando piccole forbici chirurgiche prima dell&#39;impianto. </li></ol> 2. Preparazione del mouse <ol><li> Anestetizzare topo adulto (8-12 settimane) da intraperitoneale (IP) iniezione di ketamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) e verificare che il mouse sia adeguatamente anestetizzato pizzicando punta del mouse. <ol><li> Usare pomata veterinario su occhi del mouse per prevenire la secchezza durante l&#39;esperimento. </li></ol></li><li> Shave fur su lato sinistro della gabbia toracica del mouse. </li><li> Eseguire intubazione endotracheale del mouse. </li><li> Posizionare il mouse sul basamento intubazione angolata a 70 ° e tenere in posizione il mouse agganciando suoi incisivi superiori su un piccolo elastico situato nella parte superiore del supporto. </li><li> Ritrarre delicatamente la lingua da un lato con pinze smussato. </li><li> Visualizzare la laringe con l&#39;aiuto di un microscopio a collo d&#39;oca illuminatore a fibre ottiche. </li><li> Inserire endotracheale catetere elastico (21 G) nella trachea. </li><li> Verificare che il mouse sia spontaneamente respirando in modo regolare (normale 100-150 respiri / min, senza respiro paradosso o superficiale). </li><li> Posizionare il mouse in posizione prona al microscopio di dissezione. </li><li> Meccanicamente ventilare il mouse utilizzando un ventilatore roditore (150 respiri / min e 7 ml / kg volume corrente). </li><li> Contare costole di individuare spazio intercostale tra 4 ° e 5 ° costola. </li><li> Creare un campo sterile sull&#39;area by accuratamente pulire giù con alcool e Povidone-iodio. Coprire il campo chirurgico adeguato con un telo chirurgico sterile. </li></ol> 3. mouse Chirurgia <ol><li> Dopo iniezione locale di 0,25% bupivacaina (200 microlitri) nella pelle, fare una incisione cutanea trasversale (circa 1 cm di lunghezza) sopra spazio intercostale usando forbici dissezione. </li><li> Dopo l&#39;iniezione di 0,25% bupivacaina (200 ml) nel muscolo intercostale fare un&#39;incisione muscolo tra il 4 ° e 5 ° costola con belle piccole forbici. </li><li> Inserire un divaricatore dissezione tra le costole di visualizzare completamente il polmone sinistro. <ol><li> Raschiare una piccola area (1 x 1 mm quadrato) di pleura viscerale del centro di polmone sinistro utilizzando una pinza sottile. </li><li> Applicare una leggera pressione sulla zona con un tampone di cotone sterile fino sanguinamento e perdite d&#39;aria sono completamente controllati. </li><li> Mettete piccola quantità di miscela fresca di fibrinogeno / trombina (colla di fibrina) (fase 1.1.2. 20 &amp; #181; l) sopra la zona utilizzando punta p200 pipetta. </li></ol></li><li> Posizionare delicatamente un gel di fibrina (passo 1,2) con piccole pinze sopra la zona (Figura 1b). <ol><li> Verificare che il gel è ben fissato sulla superficie durante i movimenti respiratori del polmone. </li></ol></li><li> Verificare che non vi è né perdite di aria massiccia né sanguinamento dal polmone. </li><li> Chiudi incisioni (strati muscolari e cutanee) con sutura riassorbibile, che non devono essere rimosse. </li><li> Aspirare la cavità toracica con 27 G ago e siringa da 1 ml per evitare pneumotorace. </li><li> Terminare la ventilazione meccanica. </li></ol> 4. Il recupero del mouse <ol><li> Assicurarsi che il mouse sia spontaneamente respirando in modo regolare (normale 100-150 respiri / min, senza respiro paradosso o superficiale). </li><li> IP iniettare 1 ml di pre-riscaldato 0,9% NaCl per prevenire la disidratazione. </li><li> Lasciare il mouse per recuperare sul pad circolare acqua calda. </li><li> Rimuovere il endotracheal tubo dopo aver confermato che il mouse ha respirazione stabile. </li><li> Iniettare Meloxicam (5 mg / kg, iniezione sottocutanea (SC), per 3 giorni come analgesico postoperatorio. </li><li> Monitorare i movimenti del mouse attentamente un minimo di 15 min intervalli finché è sternale (grado di rotolare sul suo stomaco e restare in piedi) e consapevole. </li><li> Dopo il recupero, ritorno il mouse in una nuova gabbia isolata da topi senza intervento chirurgico. </li><li> Monitorare il sito chirurgico per segni di infezione (rossore, gonfiore, scarico), le funzioni biologiche di base di animali (cibo e acqua presa, minzione, defecazione, corpo aumento di peso), così come i segni clinici di sofferenza (piloerezione, ridotta locomozione) al giorno dopo la procedura chirurgica. </li></ol> 5. La raccolta Polmone <ol><li> 7 a 30 giorni dopo l&#39;impianto, eutanasia il mouse utilizzando CO 2 tramite fonte di gas compresso. </li><li> Fare un&#39;incisione tra la punta del processo xifoideo e sternalenotch (sternotomia mediana) e il raccolto intero polmone con il gel impiantato per l&#39;analisi istologica e biochimica tagliando la trachea e sezionare tutti i collegamenti con il cuore, i polmoni, e la trachea. </li><li> Fissare gel impiantato con polmoni con soluzione di paraformaldeide 4% per una notte a 4 ° C, incorporare in OCT, e prendere le sezioni di passo di serie di 30 micron di spessore. </li><li> Eseguire istologico (ematossilina e eosina) e le analisi immunoistochimica (marcatore endoteliale: CD31, marcatore epiteliale: aquaporin (AQP) 5 e surfattante proteina (SP) -B) utilizzando il microscopio confocale 22,37,40. </li><li> Compilare pile di sezioni ottiche (30 micron di spessore) per formare le immagini tridimensionali di cellule endoteliali e cellule epiteliali del polmone mediante immagini 3D software di analisi 37. </li><li> Quantificare le aree proiettate dei vasi sanguigni di nuova formazione con immagine software di analisi 46. </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Questo articolo introduce un nuovo metodo per impiantare biomateriali sulla superficie del polmone di vivere topo adulto. Con questo sistema, angiogenesi ospitante polmone-derivato è ricapitolato correttamente all&#39;interno del materiale. Questo sistema permette ai ricercatori di esplorare diafonia tra le cellule endoteliali, altre cellule (ad esempio, cellule epiteliali, cellule mesenchimali, cellule immunitarie) e vari componenti ECM che sono necessari per l&#39;angiogenesi locale 50-53 e rigene...

L&#39;obiettivo generale di questo protocollo è quello di introdurre un metodo per impiantare il gel di fibrina sulla superficie del polmone di topo adulto, che permette ai ricercatori di caratterizzare i meccanismi molecolari di vascolare polmonare e sviluppo alveolare, e di sfruttare questa conoscenza per sviluppare materiali biomimetici grado di ricapitolare vascolare polmonare fisiologica e formazione alveolare per il trattamento di varie malattie polmonari. Più di 35 milioni di americani soffrono di malattie polmonari croniche, tra cui malattia polmonare ostruttiva cronica e fibrosi polmonare. Questi pazienti hanno sintomi di lunga durata croniche respiratorie, come mancanza di respiro, senso di costrizione toracica, tosse fastidiosa, e la stanchezza, che limitano considerevolmente la loro vita quotidiana 1-3. Nonostante una grande quantità di sforzo per sviluppare terapie efficaci per queste malattie polmonari, attualmente non esiste una cura; quindi, la qualità della vita di questi pazienti è scarsa ed economica e costi umani sono high 4-7. Attualmente, il trapianto di polmone è l&#39;unico modo per salvare i pazienti con stadio terminale malattie polmonari croniche. Tuttavia, a causa della carenza di donatori di trapianto, costo elevato, gravi complicazioni, e basso tasso di sopravvivenza 8-11, il trapianto non è un approccio ottimale. Recenti rapidi progressi nelle tecniche di ingegneria tissutale ha permesso ai ricercatori di bioingegnere polmone impiantabile da ripopolamento decellularized intero polmone con vari tipi di cellule progenitrici o staminali pluripotenti indotte (iPS), cellule 12,13. Tuttavia, questi polmoni bioingegneria sono funzionali in animali ospiti solo per diverse ore dopo l&#39;impianto 12,14,15. Utilizzando biomateriali per rigenerare le strutture complesse e le funzioni dei polmoni è stato abbastanza infruttuoso anche. Ciò può essere dovuto processi biologici fondamentali che regolano la rigenerazione dei polmoni per adulti non sono stati ben esplorato. Nel polmone, formazione del sistema vascolare è uno degli eventi prime e più importanti durisviluppo ng e rigenerazione 16-21. Vasculatures nuova formazione nel polmone non solo fornire ossigeno, nutrienti e vari componenti cellulari necessari per la formazione di organi, ma anche fornire segnali regolatori istruttivi alle cellule circostanti 22-25. Così, l&#39;angiogenesi svolge un ruolo chiave nel alveolarization rigenerativa nei polmoni adulti 24,26,27. Inoltre, l&#39;angiogenesi deregolamentato contribuisce a malattie polmonari croniche come la broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) 28, displasia broncopolmonare (BPD) 21-23, e la fibrosi polmonare 29. Così, per sviluppare strategie più efficaci per l&#39;ingegneria polmoni o la cura delle malattie polmonari croniche, è necessario capire i meccanismi fondamentali di angiogenesi specifici polmone. Ogni organo visualizza uniche proprietà meccaniche e chimiche, che possono differire tra le condizioni fisiologiche e patologiche 30-33. Questi microenviron organo-specificamenti regolano i comportamenti delle cellule endoteliali e orchestrare la formazione della rete vascolare in maniera specifica per organo 24,34-36. Così, per sviluppare strategie più efficaci per la rigenerazione dei polmoni, il meccanismo alla base dell&#39;angiogenesi specifici polmone deve essere capito. Mentre convenzionali in vivo test di angiogenesi come il sottocutaneo idrogel l&#39;impianto sono stati ampiamente utilizzati per la ricerca angiogenesi 37-39, questi metodi non ricapitolano angiogenesi organo-specifica. Recentemente, un nuovo metodo per impiantare Matrigel in uno stampo elastico sul polmone del mouse è stato sviluppato e dimostrato di reclutare vasi sanguigni e cellule epiteliali polmonari nei gel 22. Questo approccio unico permetterà ai ricercatori di esplorare il meccanismo di angiogenesi specifici polmone, nonché le interazioni tra i vasi sanguigni e cellule polmonari non-vascolari in condizioni fisiologiche e patologiche. Poiché 1) Matrigel non è adatto per l&#39;applicazione clinica; 2) la emuffa lastic utilizzato per lanciare il gel possono influenzare le interazioni tra idrogel e tessuto polmonare ospitante e 3) lo stampo elastico sul polmone potenzialmente causa compromissione della funzione polmonare e dolore durante la respirazione, come un approccio più clinicamente rilevante, una matrice di fibrina 3D contenente fattori angiogenetici (fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF) / base il fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF)) è stato impiantato il polmone mouse senza fusione in stampo elastico, ed è ricapitolata successo ospite angiogenesi polmone-derivato. Gel di fibrina, fibrille polimeriche generati dal fibrinogeno-trombina spaccati, è noto per intrappolare una varietà di fattori angiogenici come bFGF e VEGF per accelerare l&#39;angiogenesi in vivo 40,41. A causa della sua capacità rigenerativa e la natura biodegradabile 42, gel di fibrina è ampiamente usato nel campo dell&#39;ingegneria dei tessuti. Questo articolo introduce un approccio nuovo e unico per impiantare il gel di fibrina sulla superficie del polmone di Adul viveret mouse e dimostra che ospitano l&#39;angiogenesi polmone-derivato è ricapitolato all&#39;interno dei gel in vivo. Questo metodo, che consente ai ricercatori di studiare l&#39;angiogenesi specifici polmone, probabilmente porterà allo sviluppo di nuovi approcci terapeutici per i vari tipi di malattie polmonari e far avanzare in modo significativo gli sforzi per rigenerare con successo polmonare adulta.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="956">
	<tbody>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:343px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:177px;">Company</td>
			<td style="width:147px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:289px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Fibrinogen from human placenta</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4883</td>
			<td>For fabrication of fibrin gel</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Thrombin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9549</td>
			<td>For fabrication of fibrin gel</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Recombinant mouse VEGF 164</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>493-MV</td>
			<td>For supplementation to fibrin gel</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Recombinant mouse bFGF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3139-FB</td>
			<td>For supplementation to fibrin gel</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:343px;">Rodent Intubation Stand</td>
			<td style="width:177px;">Braintree Scientific INC</td>
			<td style="width:147px;">RIS 100</td>
			<td>For intubation</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Fiber-Optic Light Source</td>
			<td style="width:177px;">Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-35</td>
			<td>For intubation</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">20G Elastic catheter</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td>4251652-02</td>
			<td>For intubation</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:343px;">MiniVent Ventilator</td>
			<td style="width:177px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:147px;">CGS-8009</td>
			<td>For ventilation</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Stemi DV4 Steromicroscope</td>
			<td style="width:177px;">Fisher Scientific</td>
			<td>12-070-515</td>
			<td>For surgey</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Absobable suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>PDP304</td>
			<td>Surgical suture</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Antibody against CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td align="right">553370</td>
			<td>Immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Antibody against AQP5</td>
			<td style="width:177px;">Abcam</td>
			<td>AB78486</td>
			<td>Immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Antibody against SP-B</td>
			<td style="width:177px;">Millipore</td>
			<td>AB40876</td>
			<td>Immunohistochemistry</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implantation of fibrin gel on mouse lung to study lung-specific angiogenesis

I recenti progressi significativi nelle tecniche di ricerca e bioingegneria delle cellule staminali hanno fatto grandi progressi nell&#39;utilizzazione biomateriali per rigenerare e riparare i danni nei tessuti semplici nel settore ortopedico e parodontali. Tuttavia, i tentativi di rigenerare le strutture e le funzioni più complesse tridimensionali (3D) organi come polmoni non hanno avuto molto successo perché i processi biologici di rigenerazione di organi non sono stati ben esplorato. E &#39;ormai chiaro che l&#39;angiogenesi, la formazione di nuovi vasi sanguigni, gioca un ruolo chiave nella rigenerazione degli organi. Di recente formazione vasculatures forniscono non solo ossigeno, nutrienti e vari componenti cellulari che sono necessari per la rigenerazione di organi, ma anche fornire segnali istruttivi ai rigeneranti tessuti locali. Pertanto, per rigenerare successo polmoni in un adulto, è necessario ricapitolare i microambienti specifico polmonari in cui angiogenesi unità rigenerazione dei tessuti polmonari locali. Sebbene conventional saggi in vivo di angiogenesi, come impianto sottocutaneo di matrice extracellulare (ECM) ricchi di idrogel (per esempio, fibrina o collagene gel o Matrigel - miscela di proteine ​​ECM secreta dalle cellule del mouse Engelbreth-Holm-Swarm sarcoma), sono ampiamente utilizzati per esplorare la meccanismi generali di angiogenesi, angiogenesi specifici polmone non è stato ben caratterizzato, perché i metodi per l&#39;impianto ortotopico di biomateriali a livello polmonare non sono stati ben stabiliti. L&#39;obiettivo di questo protocollo è quello di introdurre un metodo unico per impiantare il gel di fibrina sulla superficie del polmone di vivere topo adulto, consentendo la ricapitolazione di successo dell&#39;ospite angiogenesi polmone-derivati ​​all&#39;interno del gel. Questo approccio consente ai ricercatori di esplorare i meccanismi con cui il microambiente specifico-polmone controlla l&#39;angiogenesi e la rigenerazione alveolare sia in condizioni normali e patologiche. Dal biomateriali impiantati rilascio e fornire segnali fisici e chimici a adiacente ltessuti ung, l&#39;impianto di questi biomateriali sul polmone malato possono potenzialmente normalizzare i tessuti malati adiacenti, consentendo ai ricercatori di sviluppare nuovi approcci terapeutici per i vari tipi di malattie polmonari.

Per esaminare se ospite polmone-derivato formazione vascolare è ricapitolato all&#39;interno dei biomateriali impiantati sul polmone, gel di fibrina integrati con i principali fattori angiogenici VEGF e bFGF (0, 10 e 100 ng / ml) sono stati impiantati sulla superficie della vita polmoni mouse come segnalato con Matrigel 22. Gel di fibrina 47 che contengono questi fattori di crescita angiogenici sono stati fabbricati come mostrato in Figura 1a. Dopo toracotomia, una piccola area de...

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Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis

Recapitulation of the organ-specific microenvironment, which stimulates local angiogenesis, is indispensable for successful regeneration of damaged tissues. This report demonstrates a novel method to implant fibrin gels on the lung surface of living mouse in order to explore how the lung-specific microenvironment modulates angiogenesis and alveolar regeneration in adult mouse.

L&#39;impianto di fibrina gel sul mouse polmone per studiare angiogenesi Lung-specifica

Recent significant advances in stem cell research and bioengineering techniques have made great progress in utilizing biomaterials to regenerate and ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

10.0K Views.  Boston Children's Hospital and Harvard Medical School. Recapitulation of the organ-specific microenvironment, which stimulates local angiogenesis, is indispensable for successful regeneration of damaged tissues. This report demonstrates a novel method to implant fibrin gels on the lung surface of living mouse in order to explore how the lung-specific microenvironment modulates angiogenesis and alveolar regeneration in adult mouse. 

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A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are administered 1. This uniqueness has made the cornea pocket assay one of the most used models for angiogenesis studies. The cornea composes multiple layers of cells. It is therefore possible to embed a pellet containing the angiogenic factor of interest in the cornea to investigate its angiogenic effect 2,3. Here, we provide a step by step demonstration of how to (I) produce the angiogenic factor-containing pellet (II) embed the pellet into the cornea (III) analyze the angiogenesis induced by the angiogenic factor of interest. Since the basic fibroblast growth factor (bFGF) is known as one of the most potent angiogenic factors 4, it is used here to induce angiogenesis in the cornea.

The cornea is unique in that it lacks vascular tissues. However, robust blood vessel growth and survival can be induced in the cornea by potent angiogenic factors. Therefore, the cornea can provide with us a valuable tool for angiogenic studies. This protocol demonstrates how to perform the mouse model of cornea pocket assay and how to assess the angiogenesis induced by angiogenic factors using this model.

Un modello murino del saggio Cornea Pocket Study Angiogenesi

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are ...

Ricerca

Medicina

Treatment of Osteochondral Defects in the Rabbit's Knee Joint by Implantation of Allogeneic Mesenchymal Stem Cells in Fibrin Clots

The treatment of osteochondral articular defects has been challenging physicians for many years. The better understanding of interactions of articular cartilage and subchondral bone in recent years led to increased attention to restoration of the entire osteochondral unit. In comparison to chondral lesions the regeneration of osteochondral defects is much more complex and a far greater surgical and therapeutic challenge. The damaged tissue does not only include the superficial cartilage layer but also the subchondral bone. For deep, osteochondral damage, as it occurs for example with osteochondrosis dissecans, the full thickness of the defect needs to be replaced to restore the joint surface 1. Eligible therapeutic procedures have to consider these two different tissues with their different intrinsic healing potential 2. In the last decades, several surgical treatment options have emerged and have already been clinically established 3-6.
Autologous or allogeneic osteochondral transplants consist of articular cartilage and subchondral bone and allow the replacement of the entire osteochondral unit. The defects are filled with cylindrical osteochondral grafts that aim to provide a congruent hyaline cartilage covered surface 3,7,8. Disadvantages are the limited amount of available grafts, donor site morbidity (for autologous transplants) and the incongruence of the surface; thereby the application of this method is especially limited for large defects.
New approaches in the field of tissue engineering opened up promising possibilities for regenerative osteochondral therapy. The implantation of autologous chondrocytes marked the first cell based biological approach for the treatment of full-thickness cartilage lesions and is now worldwide established with good clinical results even 10 to 20 years after implantation 9,10. However, to date, this technique is not suitable for the treatment of all types of lesions such as deep defects involving the subchondral bone 11.
The sandwich-technique combines bone grafting with current approaches in Tissue Engineering 5,6. This combination seems to be able to overcome the limitations seen in osteochondral grafts alone. After autologous bone grafting to the subchondral defect area, a membrane seeded with autologous chondrocytes is sutured above and facilitates to match the topology of the graft with the injured site. Of course, the previous bone reconstruction needs additional surgical time and often even an additional surgery. Moreover, to date, long-term data is missing 12.
Tissue Engineering without additional bone grafting aims to restore the complex structure and properties of native articular cartilage by chondrogenic and osteogenic potential of the transplanted cells. However, again, it is usually only the cartilage tissue that is more or less regenerated. Additional osteochondral damage needs a specific further treatment. In order to achieve a regeneration of the multilayered structure of osteochondral defects, three-dimensional tissue engineered products seeded with autologous/allogeneic cells might provide a good regeneration capacity 11.
Beside autologous chondrocytes, mesenchymal stem cells (MSC) seem to be an attractive alternative for the development of a full-thickness cartilage tissue. In numerous preclinical in vitro and in vivo studies, mesenchymal stem cells have displayed excellent tissue regeneration potential 13,14. The important advantage of mesenchymal stem cells especially for the treatment of osteochondral defects is that they have the capacity to differentiate in osteocytes as well as chondrocytes. Therefore, they potentially allow a multilayered regeneration of the defect.
In recent years, several scaffolds with osteochondral regenerative potential have therefore been developed and evaluated with promising preliminary results 1,15-18. Furthermore, fibrin glue as a cell carrier became one of the preferred techniques in experimental cartilage repair and has already successfully been used in several animal studies 19-21 and even first human trials 22.
The following protocol will demonstrate an experimental technique for isolating mesenchymal stem cells from a rabbit's bone marrow, for subsequent proliferation in cell culture and for preparing a standardized in vitro-model for fibrin-cell-clots. Finally, a technique for the implantation of pre-established fibrin-cell-clots into artificial osteochondral defects of the rabbit's knee joint will be described.

Treatment of Osteochondral Defects in the Rabbit&#039;s Knee Joint by Implantation of Allogeneic Mesenchymal Stem Cells in Fibrin Clots

An experimental technique for the treatment of osteochondral defects in the rabbit's knee joint is described. The implantation of allogeneic mesenchymal stem cells into osteochondral defects provides a promising development in the field of tissue engineering. The preparation of fibrin-cell-clots in vitro offers a standardized method for implantation.

Il trattamento dei difetti osteocondrali del ginocchio congiunta del Coniglio con impianto di cellule staminali mesenchimali allogeniche in coaguli di fibrina

The treatment of osteochondral articular defects has been challenging physicians for many years. The better understanding of interactions of articular ...

Angiogenesis in the Ischemic Rat Lung

The adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung pathologies, it is the smaller systemic vasculature that responds to a need for enhanced lung perfusion and shows robust neovascularization. Pulmonary vascular ischemia induced by pulmonary artery obstruction has been shown to result in rapid systemic arterial angiogenesis in man as well as in several animal models. Although the histologic assessment of the time course of bronchial artery proliferation in rats was carefully described by Weibel 1, mechanisms responsible for this organized growth of new vessels are not clear. We provide surgical details of inducing left pulmonary artery ischemia in the rat that leads to bronchial neovascularization. Quantification of the extent of angiogenesis presents an additional challenge due to the presence of the two vascular beds within the lung. Methods to determine functional angiogenesis based on labeled microsphere injections are provided.

The lung is perfused by both the systemic bronchial artery and pulmonary arteries. In most lung pathologies, it is the smaller systemic vasculature that shows robust neovascularization. Cessation of pulmonary blood flow promotes brisk bronchial angiogenesis. We provide surgical details of inducing left pulmonary artery ischemia that promotes bronchial neovascularization.

L&#39;angiogenesi nel polmone del ratto ischemica

The  adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire  venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

A simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or expensive animal. One of the reasons that this is not done more routinely is that it is relatively difficult, despite there being several published studies that describe ways to achieve it. In this paper we demonstrate a procedure that eliminates one of the major hurdles associated with this intubation, that of visualizing the trachea during the entire time of intubation. The approach uses a 0.5 mm fiberoptic light source that serves as an introducer to direct the intubation cannula into the mouse trachea. We show that it is possible to use this procedure to measure lung mechanics in individual mice over a time course of at least several weeks. The technique can be set up with relatively little expense and expertise, and it can be routinely accomplished with relatively little training. This should make it possible for any laboratory to routinely carry out this intubation, thereby allowing longitudinal studies in individual mice, thereby minimizing the number of mice needed and increasing the statistical power by using each mouse as its own control.

This paper describes a striaghforward and efficient method of intubating mice for pulmonary function measurements or pulmonary instillation, that allows the mice to recover and be studied at later times. The procedure involves an inexpensive fiberoptic light source that directly illuminates the trachea.

Un metodo semplice di intubazione mouse polmone

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Noninvasive Intratracheal Intubation to Study the Pathology and Physiology of Mouse Lung

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular disease and for developing therapeutic intervention. With the increasing availability of knockout and transgenic derivatives, together with a vast amount of genetic information, mice provide one of the best models to study the molecular mechanisms underlying the pathology and physiology of lung diseases. Inhalation, intranasal instillation, intratracheal instillation, and intratracheal intubation are the most widely used techniques by a number of investigators to administer materials of interest to mouse lungs. There are pros and cons for each technique depending on the goals of a study. Here a noninvasive intratracheal intubation method that can directly deliver exogenous materials to mouse lungs is presented. This technique was applied to administer bleomycin to mouse lungs as a model to study pulmonary fibrosis.

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular disease and for developing therapeutic intervention. Here a noninvasive intratracheal intubation method that can directly deliver exogenous materials to mouse lungs is presented.

Non invasivo intratracheale intubazione per studiare la Patologia e Fisiologia del mouse polmone

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the occurrence of subretinal hemorrhage can affect photoreceptor cell death in the detached retina. Hence, it is advantageous to create reproducible RDs without subretinal hemorrhage for evaluating photoreceptor cell death. We modified a previously reported method to create bullous and persistent RDs in a reproducible location with rare occurrence of subretinal hemorrhage. The critical step of this modified method is the creation of a self-sealing scleral incision, which can prevent leakage of sodium hyaluronate after injection into the subretinal space. To make the self-sealing scleral incision, a scleral tunnel is created, followed by scleral penetration into the choroid with a 30 G needle. Although choroidal hemorrhage may occur during this step, astriction with a surgical spear reduces the rate of choroidal hemorrhage. This method allows a more reproducible and reliable model of photoreceptor death in diseases that involve RD such as rhegmatogenous RD, retinopathy of prematurity, diabetic retinopathy, central serous chorioretinopathy, and age-related macular degeneration (AMD).

Creating experimental retinal detachments with a reproducible and sustained height of detachment, and without subretinal hemorrhage, is important for studying the pathophysiology of photoreceptor cell loss in retinal disease and evaluating potential therapeutic interventions. Here, we report such a method in detail.

Distacco della retina Modello in Roditori da iniezione sottoretinico di ialuronato di sodio

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences between the murine and human respiratory systems, especially in their upper respiratory tracts (URT). In some models, these differences in the murine nasal cavity can have a significant impact on disease progression and presentation in the lower respiratory tract (LRT) when using intranasal instillation techniques, potentially limiting the usefulness of the mouse model to study these diseases. For these reasons, it would be advantageous to develop a technique to instill bacteria directly into the mouse lungs in order to study LRT disease in the absence of involvement of the URT. We have termed this lung specific delivery technique intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation. This noninvasive technique minimizes the potential for instillation into the bloodstream, which can occur during more invasive traditional surgical intratracheal infection approaches, and limits the possibility of incidental digestive tract delivery. IMIT is a two-step process in which mice are first intubated, with an intermediate step to ensure correct catheter placement into the trachea, followed by insertion of a blunt needle into the catheter to mediate direct delivery of bacteria into the lung. This approach facilitates a &#62;98% efficacy of delivery into the lungs with excellent distribution of reagent throughout the lung. Thus, IMIT represents a novel approach to study LRT disease and therapeutic delivery directly into the lung, improving upon the ability to use mice as surrogates to study human respiratory disease. Furthermore, the accuracy and reproducibility of this delivery system also makes it amenable to Good Laboratory Practice Standards (GLPS), as well as delivery of a wide range of reagents which require high efficiency delivery to the lung.

Intubation-mediated Intratracheal IMIT Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation of reagents is an excellent, noninvasive method for studying respiratory disease, as well as a method for instilling therapeutic reagents directly into the lung. It is a rapid and highly reproducible method which is suitable for preclinical testing.

Intubazione-mediata intratracheale (IMIT) instillazione: A non invasiva, Lung-specifico sistema di rilascio

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered genotypes now possess the ability to invade and survive in other tissues. In this protocol, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. The cells isolated from this procedure are then available for gene profiling experiments. For successful metastasis, these cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system. The lungs are the typical target of breast cancer metastasis. A set of genes have been discovered that mediates the selectivity of metastasis to the lung. Here we describe a method of studying lung metastasis from a genetically engineered mouse model.. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. MEF cells from the same animal type provide a clue of non-cancer cell gene expression. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis, its associated signaling mechanisms and pathways of the abnormalities in embryos.

The goal of this protocol is to study breast tumorigenesis. With this technique, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. A lung extraction protocol is included for studying lung metastasis. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts from the mouse embryo is included.

Tumore primario e isolamento delle cellule MEF per studiare Lung Metastasi

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the lack of the bone microenvironment and auto/paracrine growth factors human MM cells are difficult to cultivate. Therefore, there is an urgent need to establish proper in vitro and in vivo culture systems to study the action of novel therapeutics on human MM cells. Here we present a model to grow human multiple myeloma cells in a complex 3D environment in vitro and in vivo. MM cell lines OPM-2 and RPMI-8226 were transfected to express the transgene GFP and were cultivated in the presence of human mesenchymal cells and collagen type-I matrix as three-dimensional spheroids. In addition, spheroids were grafted on the chorioallantoic membrane (CAM) of chicken embryos and tumor growth was monitored by stereo fluorescence microscopy. Both models allow the study of novel therapeutic drugs in a complex 3D environment and the quantification of the tumor cell mass after homogenization of grafts in a transgene-specific GFP-ELISA. Moreover, angiogenic responses of the host and invasion of tumor cells into the subjacent host tissue can be monitored daily by a stereo microscope and analyzed by immunohistochemical staining against human tumor cells (Ki-67, CD138, Vimentin) or host mural cells covering blood vessels (desmin/ASMA).
In conclusion, the onplant system allows studying MM cell growth and angiogenesis in a complex 3D environment and enables screening for novel therapeutic compounds targeting survival and proliferation of MM cells.

Human multiple myeloma (MM) cells require the supportive microenvironment of mesenchymal cells and extracellular matrix components for survival and proliferation. We established an in vivo chicken embryo model with engrafted human myeloma and mesenchymal cells to study effects of cancer drugs on tumor growth, invasion and angiogenesis.

Istituzione di un mieloma multiplo umano Xenograft modello nel pollo per studiare la crescita del tumore, invasione e l&#39;angiogenesi

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...

Apical Resection Mouse Model to Study Early Mammalian Heart Regeneration

Cardiovascular disease plagues the whole world due to intensive lifestyle changes. Heart regeneration holds great promise for repairing and restoring cardiomyocytes lost due to injury and disease. In contrast to the robust cardiac regeneration of certain lower vertebrates, adult mammalian hearts typically show minimal capacity for heart regeneration and repair. However, recent studies have sparked considerable scientific interest with the finding that, between postnatal day 1 to 7 (P1 to P7), the neonatal mouse heart retains significant regenerative potential after apical resection (i.e., surgical amputation and exposure of left ventricular apex). One major controversy over this finding might be due to the diverse surgery-related procedures used in efforts to replicate or expand upon this important finding. These instructions dynamically present the materials and methodology for apical resection in a mouse model. The salient steps of this rodent survival surgery involve hypothermia anesthesia, thoracotomy, surgical amputation of heart ventricular apex, and suture and recovery of mice. The approach described could expand the application of the apical resection mouse model for cardiovascular research.

A step-by-step video protocol of apical resection is demonstrated in this study. Apical resection is a recently highlighted surgical approach in mammalian heart regeneration research. This study may promote the application of apical resection as a standard methodology in research into the mechanism underlying heart regeneration.

Modello apicale resezione mouse per primo studio Mammalian rigenerazione cardiaca

Cardiovascular disease plagues the whole world due to intensive lifestyle changes. Heart regeneration holds great promise for repairing and restoring ...