Lo scopo principale di questo studio è quello di utilizzare il modello murino di legatura cecale e sepsi indotta da puntura per valutare biomarcatori ematici affidabili della sepsi. La legatura e la puntura cecale, o CLP in breve, sono un modello clinicamente rilevante di sepsi. Il CLP è un modello comunemente usato nella ricerca sulla sepsi.
L'istone citrullinato H3, o CitH3, ha origine dalla NETosi indotta dalla sepsi. Il nostro studio precedente dimostra che CitH3 è un biomarcatore diagnostico affidabile della sepsi. Seleziona topi maschi C57BL / 6.
Pesare il topo e anestetizzare il topo per inalazione di isoflurano all'1,5%. Fissare il mouse su una piastra riscaldante. Applicare la crema depilatoria sull'addome e lasciare per non più di un minuto prima di rimuovere la crema e i capelli.
Preparare strumenti chirurgici sterili adatti alla chirurgia degli animali roditori. Disinfettare la pelle addominale con iodio almeno tre volte. Coprire l'area chirurgica operatoria con il giusto panno chirurgico sterile.
Utilizzare forbici chirurgiche sterili per fare un'incisione di circa due centimetri nella parete addominale, lungo la linea alba. Identificare e isolare il cieco dalla cavità peritoneale con pinzette sterili. Ligate 75 volume del cieco con sutura di seta 4-0.
Non ligare i vasi sanguigni mesenterici. Da notare, una diversa percentuale di cieco legato determina la gravità della sepsi. Il 25% porta a una sepsi di basso grado, il 50% porta alla sepsi di medio grado e il 75% porta a una sepsi di alto grado.
Forare il cieco con una perforazione passante con un ago di calibro 21 nel punto medio tra l'estremità della coda e la legatura. Spremere delicatamente le feci dal cieco attraverso i fori di penetrazione. Da notare, la quantità di feci schiacciate nella cavità peritoneale dovrebbe essere coerente, poiché le feci determinano anche la gravità della sepsi.
Sostituire delicatamente il cieco e le feci nella cavità addominale. Chiudere lo strato muscolare addominale e lo strato di pelle con sutura di seta 6-0. Disinfettare l'incisione con iodio.
L'iniezione di ketoprofene, cinque milligrammi per chilogrammo, deve essere eseguita sul quadrante inferiore sinistro dell'addome per evitare il cieco. Posizionare il mouse su una piastra riscaldante fino al completo recupero. Il topo è alloggiato in una stanza a temperatura controllata e ha libero accesso a cibo e acqua.
Gli animali saranno sottoposti a eutanasia per overdose di anidride carbonica con sintomi di sepsi, rilevanti per i nostri endpoint predefiniti sulla base del nostro studio presentato. I topi sono divisi casualmente nel gruppo sham, nel gruppo CLP e nel gruppo di trattamento CLP più Cl-amidina o YW3-56. I topi nel gruppo fittizio ricevono tutte le procedure CLP tranne la legatura e la puntura del cieco.
Prelevare il sangue periferico a 24 ore dopo l'intervento e preparare il siero mediante centrifugazione. La concentrazione di CitH3 è stata determinata mediante western blotting e un kit ELISA auto-sviluppato. Come mostrato nella figura due, nessun CitH3 è stato rilevato nel gruppo fittizio.
I livelli di CitH3 erano elevati dopo l'inserimento di CLP, che è stato attenuato dall'inibizione della PAD in modo significativo. Sulla base dei nostri dati, concludiamo che CitH3 circolante è un biomarcatore diagnostico affidabile della sepsi.
