Il nostro protocollo è significativo, perché può essere utilizzato per creare riproducibilmente topi con un microbioma intestinale umano e un sistema immunitario umano. Chiamiamo questi topi, doppi topi umanizzati. Il modello a doppio topo umanizzato può essere utilizzato sia per la ricerca biomedica di base che traslazionale, incluso lo studio delle relazioni in vivo tra il microbioma intestinale umano e il sistema immunitario umano.
A dimostrare la procedura saranno Jianshui Zhang, un postdoc, e Yilun Chang, un dottorando del nostro laboratorio. Per impiantare i tessuti del fegato e del timo nella capsula renale sinistra, per prima cosa, posizionare il mouse in un cappuccio. Il giorno dell'intervento chirurgico, trattare i topi con irradiazione subletale per tutto il corpo a 12 centigray per grammo di dose di peso corporeo.
Radere ogni mouse attorno al lato laterale sinistro e mediale dopo aver confermato un livello appropriato di sedazione. Applicare un unguento oftalmico sugli occhi dell'animale e applicare un marchio auricolare in base alle esigenze. Disinfettare la pelle con tre iodio sequenziale e scrub isopropanolo al 70%.
Una volta che la pelle è stata predisposta, utilizzare le forcelle per caricare da uno a sei millimetri di frammento di tessuto fetico fetale umano a cubetti in un trocar, seguito da un frammento di tessuto di timo fetale umano a cubetti da uno a 1,6 millimetri. Utilizzare le forcep per sollevare la pelle e utilizzare un bisturi per fare un piccolo taglio longitudinale nella pelle. Estendere il taglio a 1,5 a due centimetri sul lato sinistro del mouse.
E usa le forcep per sollevare lo strato muscolare. Utilizzare le forbici per aprire lo strato muscolare longitudinalmente, estendendo il taglio se necessario per esporre il rene e afferrare delicatamente il tessuto adiposo che circonda il rene. Utilizzare un bisturi per fare un'incisione da uno a due millimetri all'estremità posteriore della capsula renale e inserire lentamente il trocar precaricato nell'incisione parallela al lungo asse del rene.
Rilasciare i tessuti tra la capsula renale e il rene e riportare il rene e l'intestino nelle loro posizioni normali. Quindi, usa le suture per chiudere lo strato muscolare e le graffette chirurgiche per chiudere la pelle. Posizionare il mouse in una gabbia di microisolatore autoclavato con monitoraggio fino alla completa reclinabilità.
Sei ore dopo l'intervento, posizionare i topi sotto una lampada termica e disinfettare le code con il 70% di isopropanolo. Iniettare da 1,5 a cinque volte da 10 a cinque CD34 positivo tessuto fetico fetale umano isolato cellule staminali emopoietiche in 200 microlitri di PBS in una vena di coda dilatata per animale. Quindi fermare qualsiasi sanguinamento con una leggera pressione e riportare i topi nella loro gabbia di casa.
Da nove a 12 settimane dopo l'intervento chirurgico, utilizzare un sistema di ritenuta per pettine di plastica di dimensioni appropriato per isolare una gamba di un topo umanizzato e spruzzare il lato mediale della gamba isolata con il 70% di isopropanolo. Stendere unguento antibiotico e antidolorifici nel sito di raccolta. Utilizzando un ago calibro 25 tenuto con un angolo di 90 gradi, forare la vena safenosa per raccogliere da 50 a 100 microlitri di sangue in un tubo di raccolta del sangue rivestito di EDTA.
Quando è stato ottenuto un volume adeguato di sangue, applicare pressione sul sito con un pezzo sterile di garza per fermare il sanguinamento prima di riportare il mouse nella sua gabbia. Quindi utilizzare il campione di sangue periferico raccolto per valutare il livello di ricostituzione delle cellule immunitarie umane mediante citometria a flusso utilizzando anticorpi contro CD45, CD3, CD4, CD8, CD19 e CD45 del mouse. Per la raccolta di campioni fecali freschi, posizionare i singoli sacchetti di carta autoclavati in un cappuccio dei fumi e posizionare un mouse in ogni sacchetto fino a quando ogni animale non defeca.
Quindi riportare i topi nella loro gabbia e utilizzare forcep sterili per trasferire ogni campione fecale in un tubo da 1,5 millilitri per topo per meno 80 gradi Celsius. Alla fine del trattamento antibiotico di 14 giorni, cambiare l'acqua potabile in acqua sterilizzata autoclavata e trasferire i topi in una nuova gabbia autoclavata. 24 e 48 ore dopo la cessazione degli antibiotici scongelano fonti adeguatamente preparate di materiale da trapianto di microbiota fecale e aliquotano i campioni in una camera anaerobica in condizioni anaerobiche.
Per eseguire un trapianto fecale, consegnare 200 microlitri di materiale da trapianto di microbiota fecale tramite gavage orale a ciascun animale sperimentale e diffondere qualsiasi materiale disgelato rimanente sulla pelliccia di topi umanizzati o sulla lettiera della gabbia. Qui viene mostrato un esempio di analisi citometrica del flusso del sangue periferico da un topo BLT umanizzato 10 settimane dopo l'intervento chirurgico. Le popolazioni cellulari T e B possono essere identificate, così come i sottoinsiemi di cellule T positive CD4 e CD8.
In questo grafico si può osservare l'abbondanza relativa dei campioni di donatori fecali umani utilizzati per trasferire un microbioma intestinale per creare doppi topi umanizzati. Le modifiche fenotipiche alla milza e al cieco indotte dal trattamento antibiotico sono simili a quelle osservate negli animali senza germi. Questo grafico di analisi dei componenti principali dei dati rappresentativi di sequenziamento dell'RNA ribosomiale 16S rivela che i doppi topi umanizzati hanno microbiomi intestinali simili all'uomo che sono unici per il campione di donatore umano.
L'aspetto più critico di questo protocollo è limitare l'introduzione di batteri indesiderati per garantire che i topi rimangano sani e mantengano il microbioma intestinale umano. Questo modello ha il potenziale per far progredire la medicina personalizzata e per permetterci di esaminare come la malattia umana influisce sul microbioma intestinale controllando al contempo altri fattori attenuanti.
