Questo protocollo descrive un metodo rapido e semplice per generare colture primarie di melanociti e fibroblasti dai topi. Poiché questa tecnica non richiede che l'epidermide e il derma siano separati, può essere eseguita in modo rapido e coerente con un allenamento minimo. Questo metodo può essere utilizzato per studiare la biologia dei melanociti cutanei e dei fibroblasti.
Gli esperimenti in queste culture possono fornire informazioni rilevanti per il cancro, la guarigione delle ferite e i difetti di pigmentazione. Prima di iniziare, assicurarsi di preparare tutti i reagenti necessari e controllare la temperatura del bagno d'acqua. Se si prevede di elaborare più campioni, fare riferimento alla guida al ridimensionamento dei reagenti nella tabella uno.
A dimostrare questa procedura sarà Brandon Murphy, uno studente laureato del mio laboratorio. In un armadio a flusso laminare, arrotolare brevemente il tronco di ogni topo eutanasiato in una piastra di Petri sterile contenente il 70% di etanolo. Rimuovere il topo dall'etanolo e posizionarelo in una piastra di Petri sterile vuota.
Successivamente, sterilizzare le forbici chirurgiche con il 70% di etanolo. Usa queste forbici per fare un'incisione nella pelle sul lato ventrale del tronco, partendo dal collo e continuando fino alla coda. Usando forcelle sterili, rimuovere la pelle dal tronco del topo e rimuovere il tessuto adiposo in eccesso dal lato dermico della pelle.
Posizionare la pelle, con il derma lato verso il basso, in un piatto di sei po 'contenente tre millilitri di soluzione antimicotica antibiotica 1X. Incubare a temperatura ambiente per due o tre minuti. Quindi, accendi l'elicottero tissutale e regola le impostazioni su quelle mostrate qui.
Assicurarsi di prestare attenzione quando si installa la lama dell'elicottero del tessuto e quando si opera la macchina. Trasferire la pelle, il derma lato verso il basso, in un piatto sterile di elicottero di tessuto e passare completamente la pelle attraverso l'elicottero tissutale tre volte. Successivamente, trasferire la pelle omogeneizzata in un tubo conico sterile da 15 millilitri contenente tre millilitri di tampone di digestione cutanea.
Utilizzando una micro-pipetta P1000, mescolare la sospensione risultante tubazione su e giù vigorosamente da 10 a 15 volte. Limitare il tubo conico e incubare il campione in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 15 minuti, assicurandosi di invertire il tubo ogni tre o cinque minuti. Quindi, centrifugare il tubo in un rotore a secchiello oscillante a 750 volte G a temperatura ambiente per cinque minuti per pellereggiare le cellule nell'omogeneato cutaneo.
Utilizzare una micro-pipetta P1000 per rimuovere lentamente e completamente il tampone di digestione della pelle, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Assicurati di aspirare tutto il tampone di digestione della pelle. In caso di problemi, lavare il pellet cellulare con due o tre mils di mezzi melanociti e ripetere la centrifugazione e rimuovere il tampone di digestione della pelle in eccesso.
Quindi rimescolare accuratamente il pellet cellulare in un millilitro di mezzi di melanocita pipettando su e giù da 15 a 20 volte con una pipetta P1000. Trasferire la soluzione cellulare risultante cadere saggiamente in un pozzo non rivestito in un piatto di sei pozzetti che contiene un millilitro di mezzi di melanocita. Incubare l'omogeneato cutaneo placcato in un incubatore di coltura tissutale a 37 gradi Celsius con anidride carbonica del 5% per 40 minuti.
Successivamente, trasferire il supernatante di coltura dal piatto non rivestito a un pozzo di un piatto di collagene pre-lavato rivestito con sei porci. Aggiungere G-418 al supporto, in modo che la concentrazione finale sia di 100 nanogrammi per millilitro. Aggiungere due millilitri di mezzi fibroblasti a un pozzo del piatto non rivestito che ora contiene fibroblasti aderenti.
Incubare entrambe le colture durante la notte in un incubatore di coltura tissutale a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica. Dopo 16-24 ore di incubazione, aspirare separatamente il supporto e gli eventuali detriti di ogni coltura. Lavare ogni piatto due volte utilizzando un millilitro di PBS per ogni lavaggio.
Quindi, aggiungere due millilitri di mezzi melanociti freschi alla coltura di melanociti e aggiungere due millilitri di mezzi fibroblasti freschi alla coltura dei fibroblasti. In questo studio, le colture di fibroblasti e melanociti vengono generate simultaneamente dallo stesso campione cutaneo. Quando la pelle omogeneizzata viene placcata per la prima volta, il supporto appare torbido.
Tuttavia, dopo l'incubazione conglomerati cellulari più grandi e fibroblasti cellulari aderenti diventano visibili nel piatto. Le cellule non aderenti della coltura vengono trasferite in un piatto rivestito di collagene e trattate con G-418. I fibroblasti uccisi dal G-418 sono visti galleggiare nel mezzo di coltura del melanocita per i prossimi cinque giorni.
Dopo quattro o cinque giorni di coltura, i melanociti placcati iniziano ad assumere un fenotipo dendritico con granuli melanocitici. Questo fenotipo persiste al momento della passaging, mentre si perdono ammassi di cheratinociti contaminanti. La purezza delle colture di melanociti e fibroblasti risultanti è confermata utilizzando la citometria a flusso.
L'espressione del marcatore di melanocita GP100 è specifica delle colture di melanociti, mentre il marcatore di fibroblasti, FSP1, si trova esclusivamente nei fibroblasti primari. Le cellule cheratinociti C59 di controllo sono le uniche colture che macchiano positive per il marcatore cheratinocita, K14. Ulteriori analisi vengono eseguite per determinare quanto tempo ci vuole per stabilire colture di melanociti arricchite.
Le cellule positive GP100 iniziano ad apparire il quarto giorno e picco dopo 10 giorni in coltura. Questa procedura può essere utilizzata per generare rapidamente colture di melanociti e fibroblasti per una varietà di saggi omici in vitro e ad alta produttività.
