Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione gm118085 dei National Institutes of Health e in parte dalla Robert Welch Foundation (sovvenzione F-1811 a R.M.H.).

1. Isolamento dei mutanti soppressori in ceppi carenti di motilità
NOTA: Utilizzare questo metodo come un ampio "catch-all" per identificare la natura generale del difetto di motilità.
<ol><li>Preparazione piastra soft-agar NOTA: Soft-agar, noto anche come motilità o agar da bagno, è un agar a bassa percentuale (~0,2-0,35% w/v), a lungo usato per saggiare chemiotassi31,32.<ol>
<li>Aggiungere 3 g di bacto-agar (0,3% w/v) e 20 g di LB in un pallone inferiore rotondo da 2 L. Aggiungere 1 L di ddH2O (acqua a doppia distillazione) al pallone e mescolare uniformemente la sospensione utilizzando un'asta di agitazione e una piastra di agitazione magnetica.</li>
		<li>Autoclave per 20 min a 121 °C.</li>
		<li>Lasciare raffreddare con delicata agitazione utilizzando l'asta / piastra come sopra. Quando la temperatura raggiunge circa 50 °C, versare 25 mL in piastre di Petri sterili (100 mm x 15 mm) e lasciare che l'agar fuso si metta con coperchio in posizione per almeno 1 h, da utilizzare entro 16 ore.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione della cultura, inoculazione e isolamento dei mutanti soppressori NOTA: E. coli inoculato al centro di mezzi ricchi di nutrienti solidificati con agar morbido consumano nutrienti localmente, creando un gradiente nutritivo che seguono. Mentre si spostano verso l'esterno, compaiono "anelli" definiti (Figura 1A), che sono correlati a specifici chemioatattanti a cui i batteri rispondono. Difetti nel sistema chemiotassi o componenti strutturali del motore flagella possono compromettere le prestazioni in questo saggio. Spesso, i mutanti con un vantaggio di motilità sorgono durante lo screening e possono essere visti emergere da singoli o da più punti lungo la periferia dell'anello, da dove "divampano"(Figura 1C). Si noterà che il bordo più esterno del fronte di nuoto contrasta prontamente con l'agar morbido vergine non colato.<ol>
<li>Coltivare colture notturne del ceppo desiderato carente di motilità in 5 mL di Brodo di Lennox (LB; 10 g/L di triptono, 5 g/L di estratto di lievito e 5 g/L NaCl, Tabella dei Materiali)a 30 °C con scuotimento orizzontale (220 r.p.m.). Il giorno seguente, la sottocultura (diluizione 1:100) in LB fresco, crescendo nelle stesse condizioni fino alla fase esponenziale (OD600 di 0,6).</li>
		<li>Inoculare 6 μL della coltura al centro di una piastra di agar morbido (1.1) utilizzando una pipetta, spingendo la punta sterile caricata nell'agar per espellere delicatamente il contenuto. Trasferimento a 30 °C e incubare (Figura 1B), fino a quando i "brillamenti" di motilità sono evidenti, emanando dal punto di inoculazione o dalla periferia degli anelli di motilità, tipicamente in 24-36 h(Figura 1C). NOTA: Nei saggi di motilità, inoculare un ceppo di tipo selvatico insieme agli isolati mutanti per il confronto. Questo ceppo di tipo selvatico mostrerà i caratteristici anelli chemiotattici concentrici(Figura 1A)e riempirà la piastra entro 8-10 ore.</li>
		<li>Utilizzare un filo-loop sterile per sollevare le cellule dalla regione e dalla striscia "flare" per purificare singole colonie su una piastra di agar duro LB (LB preparata come sopra, solidificata con bacto-agar da 15 g/L).</li>
		<li>Scegli singole colonie dalla piastra di striscia usando un anello di filo sterile e purificale striature per singole colonie per garantire l'isolamento di una colonia "pura" isolata.</li>
	</ol></li>
	<li>Conferma e caratterizzazione dei mutanti soppressori
	<ol>
<li>Verificare che i mutanti soppressori isolati abbiano ripristinato la motilità. Preparare piastre di agar morbido (1.1) e colture per ceppi di interesse (come al punto 1.2.1), compresi i tipi selvatici e il ceppo iniziale "carente di motilità" per il confronto.</li>
		<li>Inoculare le piastre (come in 1.2.2) e incubare a 30 °C per 8-10 h.</li>
		<li>Registrare il diametro dell'anello più esterno (bordo del cerchio) e confrontare per stabilire quale degli isolati ha sostanzialmente ripristinato la motilità. NOTA: Si raccomanda di fotografare le lastre durante tutto il corso del tempo dell'esperimento. Per ottenere i migliori risultati, utilizzare un dispositivo "secchiello diluce" 30, in cui una fotocamera digitale è montata sopra una sorgente luminosa per una migliore illuminazione per misurare il diametro della colonia di nuoto e distinguerla dall'agar non raggruppato.</li>
		<li>Soggetto isolato in WGS come richiesto, consentendo una sufficiente "copertura della sequenza" per identificare positivamente le mutazioni che hanno ripristinato la funzione di tipo selvaggio.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Quantificare il comportamento motorio della flagella tramite il tethering cellulare
NOTA: utilizzare questo metodo quando il normale comportamento run-tumble (chemiotaxis) sembra essere compromesso.
<ol><li>
Preparazione della cultura e tosatura della flagella
	<ol>
<li>Preparare una cultura di fase esponenziale del ceppo di interesse come descritto al passaggio 1.2.1.</li>
		<li>Pellet 10 mL di cellule per centrifugazione a 2.000 x g per 3 minuti prima di rimescolare in 10 mL di Motiliity Buffer sterilizzato con filtro (MB; Tampone fosfato di potassio da 10 mM [0,0935 M K2HPO4, 0,0065 M KH2PO4, pH 7,0], 0,1 mM EDTA [pH 7,0], NaCl da 10 mM, 75 mM KCl). NOTA: MB supporta la motilità, ma non supporta la crescita batterica</li>
		<li>Ripetere il passaggio 2.1.2 altre due volte prima di rimospendere il pellet finale in 1 mL di MB.</li>
		<li>Trasferire la sospensione cellulare in una siringa da 1 ml e attaccare un ago 23G all'estremità. Assemblare un identico apparato siringa/ago e fissare i due insieme tramite 6 pollici di tubi di polietilene (diametro interno di 0,58 mm) strettamente infilati su ogni punta dell'ago.</li>
		<li>Tosare la flagella (sono fragili e si rompono facilmente) passando delicatamente la sospensione cellulare avanti e indietro da una siringa all'altra 50x, con 1 min di pausa tra ogni 10 passaggi.</li>
		<li>Centrifugare le cellule tranciate a 2.000 x g per 3 minuti e rimombidare in un volume finale di 500 μL di MB.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione delle diapositive e tethering cellulare
	<ol>
<li>Preparare una camera di fissazione delle celle impilando un coverslip da 18 mm x 18 mm su uno scivolo da microscopio in vetro da 3 pollici x 1 pollice x 1 mm, separato da nastro a doppia parte (Figura S1).</li>
		<li>Sciacquare la camera con soluzione di polilisina 0,01% (w/v) applicandosi sulla parte superiore della camera. Inclinare il bordo inferiore (il coverslip flush con lo scivolo del microscopio) su un tergicristallo (carta velina) per aiutare a disegnare la soluzione attraverso la camera (Figura S1). Quindi incubare a temperatura ambiente per 10 minuti.</li>
		<li>Lavare la camera tre volte con 40 μL di MB utilizzando come descritto al passaggio 2.2.2</li>
		<li>Aggiungere 40 μL della sospensione cellulare tranciata (preparata sopra) nella parte superiore della camera e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti per consentire alle cellule di attaccarsi al coperchio.</li>
		<li>Sciacquare delicatamente la camera con 40 μL di MB come in 2.2.3 per rimuovere le celle non attaccate.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Registrazione e quantificazione della rotazione cellulare
	<ol>
<li>Trasferire lo scivolo del microscopio caricato con celle tethered allo stadio del microscopio.</li>
		<li>Utilizzando la microscopia a contrasto di fase e un obiettivo 100x, scansionare la popolazione alla ricerca di cellule fissate in posizione e ruotare su un singolo asse, o cioè rotazioni lisce su un punto fisso piuttosto che presentarsi con un angolo in cui la cella si muove in uscita e fuori fuoco (Video 1).</li>
		<li>Utilizzare un microscopio commerciale e la fotocamera associata. Aprire il software associato, assicurarsi che le celle di interesse siano a fuoco e fare clic sull'acquisizione video per registrare la rotazione delle celle per un minuto (a 10 fotogrammi al secondo o superiore).</li>
		<li>Dalla riproduzione video, quantificare il numero di rotazioni complete al minuto e il numero di volte in cui la cella cambia direzione (frequenza di commutazione). NOTA: Le velocità di rotazione e la frequenza di commutazione possono essere troppo veloci per essere misurate a occhio, quindi si consiglia di utilizzare un software video che offre una riproduzione lenta / fine o adotta un sistema software automatizzato per quantificare i patternrotazionali 33. Un'alternativa sarebbe aumentare la viscosità dell'MB usando la cellulosa metile (o agente simile) per aiutare a rallentare e risolvere la rotazione di batteri più veloci o compensare quando sono in uso telecamere con bassi framerate.</li>
		<li>Ripetere il passaggio 2.3.2 con repliche biologiche per compilare una rappresentazione della popolazione di interesse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Preparazione di sciami in un saggio di attraversamento della frontiera
NOTA: Utilizzare questo metodo per valutare l'impatto di una mutazione o condizione sulla motilità di gruppo. Swarm-agar si riferisce all'agar dove la percentuale è tipicamente superiore a quella di soft-agar. Nell'agar morbido (0,3 %), le cellule nuotano individualmente all'interno dell'agar. Nell'agar dello sciame (0,5% e oltre), le cellule si muovono come gruppo sulla superficie. Mentre le piastre dello sciame devono essere utilizzate come descritto in dettaglio qui, le piastre da bagno hanno una durata di conservazione più lunga e possono essere utilizzate per diversi giorni. La nostra preferenza personale è da utilizzare in 1-2 giorni.
<ol><li>
Preparazione dell'agar sciame
	<ol>
<li>Aggiungere 5 g di agar Eiken (0,5% w/v) e 20 g di LB in un pallone inferiore rotondo da 2 L. Aggiungere 1 L di ddH2O al pallone e mescolare uniformemente la sospensione utilizzando un'asta di agitazione e una piastra di agitazione magnetica.</li>
		<li>Autoclave per 20 min a 121 °C.</li>
		<li>Lasciare raffreddare con delicata agitazione per evitare bolle d'aria utilizzando l'asta / piastra come sopra. Quando si aggiungono circa 50 °C, aggiungere glucosio sterilizzato con filtro per una concentrazione finale dello 0,5 %.</li>
		<li>Versare 25 mL in piastre di Petri sterili (100 mm x 15 mm) e lasciare impostare a temperatura ambiente per almeno 14 ore e non più di 20 ore. Non conservare per un uso futuro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Inoculazione e incubazione di piastre sciame
	<ol>
<li>Inoculare 6 μL di una coltura medio-esponenziale (preparata come in 1,2) individuando sopra l'agar.</li>
		<li>Lasciare il coperchio spento per 5-10 minuti e sostituire quando l'inoculo si è asciugato nella superficie dell'agar.</li>
		<li>Incubare a 30 °C per 8 ore. Evita la tentazione di ispezionare i progressi dello sciame rimuovendo il coperchio, in quanto ciò contribuirà all'asciugatura dell'agar e compromette lo sciame. NOTA: Il tempo di incubazione può variare a seconda del fenotipo di deformazione. Alcune mutazioni isolate possono ostacolare la capacità di sciame e richiederanno una ridotta percentuale di agar o un periodo di incubazione più prolungato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione di targhe di dosaggio transfrontaliere NOTA: Questo saggio utilizza una piastra di Petri modificata, in cui una divisione di plastica (bordo) crea due camere, anziché una (Figura 2A). Ogni camera può essere preparata indipendentemente dall'altra, offrendo condizioni diverse per lo sciame, prima di "collegare" le due. A seconda del design sperimentale, la prima camera (designata a sinistra) può essere preparata con agar da bagno (0,3% w/v) o agar sciame (0,5% w/v) da cui i batteri possono migrare attraverso il confine nella camera destra contenente agar sciame +/- qualsiasi integratore o sfida richiesta (ad esempio, antibiotici). La migrazione su entrambi gli agar viene tipicamente misurata/confrontata registrando il diametro più ampio della colonizzazione batterica (da bordo a bordo) dal punto originale di inoculazione.<ol>
<li>Preparare l'agar da bagno come descritto al punto 1.1, se necessario.</li>
		<li>Preparare l'agar dello sciame come descritto al punto 3.1.</li>
		<li>Versare ~30 mL di agar sciame (con l'integrazione desiderata se necessario) nella camera destra di una piastra di Petri a doppio compartimento (100 mm x 15 mm), al punto in cui è livellata con il divisore di plastica tra le camere, ma non traboccante a sinistra(Figura 2B).</li>
		<li>Dopo che l'agar si è indurito, riempire la camera sinistra con ~ 30 mL di agar da bagno o sciame, di nuovo al punto di contatto con il diviso di plastica(Figura 2C). Prima di impostarlo, utilizzare una punta sterile per trascinare delicatamente l'agar oltre il bordo per collegare i due lati con un ponte di agar alto ~ 1 mm che si estende per l'intera lunghezza della divisione (Figura 2D).</li>
		<li>Lasciare asciugare la piastra a temperatura ambiente (3.1). NOTA: Un metodo alternativo per creare il ponte è consentire all'agar della camera sinistra di asciugarsi e quindi pipettare lentamente ~ 100 μL di agar sciame fuso lungo il divisore di plastica per collegare le due camere (3.4). Inoculare le piastre sulla camera sinistra come sopra dettagliato per nuotare (1.2.2) o sciame (3.2) agar, prima di incubare a 30 °C per 12-16 ore, o fino a quando gli sciami non hanno fatto progressi sufficienti sulla camera destra per consentire confronti tra ceppi di interesse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L'isolamento e la caratterizzazione delle mutazioni soppressori hanno contribuito con successo all'identificazione dei componenti chiave del sistema chemiotassi35,36,37,nonché della macchina motorestessa 38,39,40. Durante l'utilizzo del protocollo 1, è importante includere più repliche indipendenti per garantire l'isolamento di un am...

I batteri impiegano molte appendici per il movimento e la dispersione nelle loro nicchie ecologiche1. La motilità guidata dalla flagella è la più veloce di queste, promuovendo la colonizzazione di località favorevoli in risposta ai segnali ambientali e contribuendo in modo significativo alla capacità patogena di alcunespecie 2,3. I batteri flagellati possono nuotare individualmente in liquido sfuso o sciamare collettivamente su una superficie semi-solida4. La flagella extracellulare si attacca e viene guidata da motori rotanti incorporati nella membrana, che sfruttano la potenza dei gradienti ionici per generare coppia che causala rotazione 1,2,4,5,6,7,8. In E. coli, i cui motori funzionano a una coppia costante 9 , l'uscita del motore può essere classificata in termini di velocità di rotazione e commutazione del rotore tra direzioni antiorario (CCW) e in senso orario (CW). La rotazione CCW promuove la formazione di un fascio flagellare coerente che spinge la cella in avanti (corsa), mentre un interruttore transitorio in direzione rotazionale (CW) fa sì che il fascio si smonti parzialmente o completamente10e la cella riorienti la sua direzione di nuoto (tumble). E. coli in genere corre per un secondo e cade per un decimo di secondo. La frequenza di commutazione del rotore o "tumble bias" è controllata dal sistema di segnalazione chemiotassi, in cui i chemorecettori transmembrana rilevano segnali chimici esterni e li trasmettono tramite fosforelay al motore flagellare per estendere le corse in risposta agli attrattori, o sopprimerle in risposta asostanze chimiche tossiche 11,12. La motilità del nuoto viene saggiata in un agar morbido dello 0,3%.
Durante lo sciame, i batteri navigano su una superficie semi-solida come un collettivo denso, dove branchi di batteri srotoleggiano in un movimento vorticosocontinuo 2,13,14,15. Gli sciami di E. coli mostrano una fisiologia chemiosensoriale alterata (distorsione della caduta inferiore), velocità più elevate e maggiore tolleranza agli antimicrobici sulle cellule che nuotano nel liquido sfuso16,17. Gli sciami variano nella loro implementazione di una pletora di strategie che aiutano il movimento, tra cui la produzione di tensioattivi, l'iperflagellazione e l'allungamento cellulare2. Lo sciame offre ai batteri un vantaggio competitivo sia in contesti ecologici checlinici 18,19,20. Ci sono due categorie di batteri brulicanti: sciami temperati, che possono sciamare solo su supporti solidificati con agar 0,5-0,8%, e sciami robusti, che possono navigare attraverso concentrazioni di agar piùelevate 21.
Esistono una varietà di saggi per interrogare la motilità del nuoto e la sua regolazione. Se compromessa da mutazioni o condizioni ambientali, la motilità stessa offre una forte selezione per identificare le mutazioni soppressori del guadagno di funzione. Questi soppressori possono essere veri revertanti della mutazione originale, o pseudo-revertanti, dove una seconda mutazione ripristina la funzionalità. Tali mutanti possono essere identificati dal sequenziamento dell'intero genoma (WGS). Un'alternativa alla selezione imparziale del soppressore è una strategia di mutagenesi mirata distorta (ad esempio, mutagenesi PCR). Queste metodologie spesso fanno luce sulla funzione o sulla regolazione ambientale dell'apparato di motilità. Se l'obiettivo è quello di studiare la funzione motoria, allora il ripristino della motilità di tipo selvaggio misurata in agar morbido potrebbe non indicare necessariamente il ripristino della produzione motoria di tipo selvaggio. Il saggio di tethering cellulare, in cui le cellule sono attaccate a una superficie di vetro da un singolo flagello e la rotazione del corpo cellulare viene successivamente monitorata, può essere il saggio iniziale di scelta per valutare il comportamento motorio. Sebbene siano ora disponibili metodologie più sofisticate per monitorare le proprietà del motore, la necessaria configurazione e applicazione di pacchetti software per l'analisi del movimento limita il loro usodiffuso 22,23,24,25. Il saggio di tethering cellulare richiede solo che la flagella sia tranciata, consentendo l'attacco dei filamenti corti a uno scivolo di vetro, seguito da una videoregistrazione della rotazione del corpo cellulare. Sebbene le velocità motorie registrate siano basse in questo saggio a causa dell'elevato carico che il corpo cellulare esercita sul flagello, questo saggio ha comunque contribuito a preziose intuizioni sulle risposte chemiotattiche26,27,28,29e rimane un valido strumento investigativo come discusso di seguito.
La motilità brulicante pone una serie diversa di sfide ai ricercatori. La selezione dei soppressori di guadagno di funzione funziona solo in sciami che producono abbondanti tensioattivi e sciamiprontamente 13. I non produttori tensioattivi come E. coli sono esigenti per quanto riguarda la scelta dell'agar, la composizione dei media e l'umiditàdell'ambiente 2,13,14,21. Una volta stabilite le condizioni di sciame, il saggio di attraversamento dellafrontiera 17 è una metodologia utile per interrogare la capacità di uno sciame di navigare in condizioni nuove / difficili. Sebbene i protocolli presentati di seguito riguardino E. coli, possono essere facilmente adattati per l'applicazione in altre specie.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto Dehydrated Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0140-15-4</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Disodium Salt, Dihydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-002-786</td><td></td></tr><tr><td>Eiken agar</td><td>Eiken Chemical Co. Japan</td><td>E-MJ00</td><td>Essential for E. coli swarming</td></tr><tr><td>Glucose D (+)</td><td>Fisher Scientific</td><td>410955000</td><td></td></tr><tr><td>LB (Lennox) Broth</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine Solution (0.1%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-605-496</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate monobasic (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate dibasic (K2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials and Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellSense microscope imaging software (V. 1.6)</td><td>Olympus</td><td></td><td>Or equivalent software for microscope used</td></tr><tr><td>Electron Microscopy Sciences Scotch 666 Doube Sided Tape</td><td>Fisher</td><td>50-285-28</td><td></td></tr><tr><td>Frosted microscope slides 3x1x1mm</td><td>Fisher</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX53 microscope</td><td>Olympus</td><td>BX53</td><td>Any upright or inverted phase microscope can be used</td></tr><tr><td>Petri dishes (100 mm diameter)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>For soft-agar assays</td></tr><tr><td>Polyethylene Nebulizer Capillary Tubing (0.58mm x 99mm 3.0m)</td><td>Perkin Elmer</td><td>9908265</td><td></td></tr><tr><td>Round Petri Dish with 2 Compartments</td><td>VWR</td><td>89200-944</td><td>For border-crossing assays</td></tr><tr><td>Safety Hypodermic Needles (23G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826A</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Syringe - 1 mL</td><td>Fisher scientific</td><td>14-955-450</td><td></td></tr><tr><td>Task/Tissue wipes</td><td>Fisher scientific</td><td>06-666</td><td>Or equivalent single use tissue wipes</td></tr><tr><td>VWR micro cover-glass 18x18mm</td><td>VWR</td><td>48366205</td><td></td></tr><tr><td>XM10 camera</td><td>Olympus</td><td>XM10</td><td>Or equivalent microscope camera</td></tr></tbody></table>

investigating flagella-driven motility in escherichia coli by applying three established techniques in a series

La motilità è fondamentale per la sopravvivenza e il successo di molte specie batteriche. Esistono molte metodologie per sfruttare la motilità per comprendere i percorsi di segnalazione, per chiarire la funzione e l'assemblaggio delle parti flagellari e per esaminare e comprendere i modelli di movimento. Qui dimostriamo una combinazione di tre di queste metodologie. La motilità nell'agar morbido è la più antica, offrendo una forte selezione per isolare le mutazioni soppressori del guadagno di funzione nei ceppi compromessi dalla motilità, dove la motilità viene ripristinata attraverso una seconda mutazione. La tecnica di tethering cellulare, utilizzata per la prima volta per dimostrare la natura rotante del motore flagellare, può essere utilizzata per valutare l'impatto degli effettori di segnalazione sulla velocità del motore e la sua capacità di cambiare direzione rotazionale. Il saggio "border-crossing" è più recente, dove i batteri del nuoto possono essere innescati per passare a muoversi collettivamente come uno sciame. In combinazione, questi protocolli rappresentano un approccio sistematico e potente per identificare i componenti del macchinario di motilità e per caratterizzare il loro ruolo in diverse sfaccettature del nuoto e dello sciame. Possono essere facilmente adattati per studiare la motilità in altre specie batteriche.

L'isolamento degli pseudo-revertanti in un ceppo E. coli la cui motilità è compromessa da alti livelli della molecola di segnalazione c-di-GMP, è stato descritto in recente lavoro del nostro laboratorio34. Questo ceppo (JP1442) ha ospitato due mutazioni: ΔyhjH e ΔycgR. YhjH è la fosfodiesterasi più attiva che degrada il c-di-GMP in E. coli. L'assenza di YhjH porta ad elevati livelli di c-di-GMP e all'inibizione della motilità. YcgR è un effettore c-di-G...

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Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Molti batteri usano la motilità guidata dalla flagella per navigare nel loro ambiente e colonizzare un ambiente favorevole sia individualmente che collettivamente. Qui è dimostrato l'uso di tre metodi consolidati che sfruttano la motilità come strumento di selezione per identificare componenti / percorsi che contribuiscono al nuoto e alla motilità brulicante.

Investigare la motilità guidata dalla Flagella in Escherichia coli applicando tre tecniche consolidate in una serie

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, ...

investigating-flagella-driven-motility-escherichia-coli-applying

Research

JoVE Journal

Biology

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

7.6K Views.  The University of Texas at Austin. Molti batteri usano la motilità guidata dalla flagella per navigare nel loro ambiente e colonizzare un ambiente favorevole sia individualmente che collettivamente. Qui è dimostrato l'uso di tre metodi consolidati che sfruttano la motilità come strumento di selezione per identificare componenti / percorsi che contribuiscono al nuoto e alla motilità brulicante.

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Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

The method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of curli genes under the control of a strong and metal-overinducible promoter, and in visualizing and quantifying the resulting gain of bacterial adherence. This method applies appropriate engineering principles of abstraction and standardization of synthetic biology, and results in the BBa_K540000 Biobrick (Best new Biobrick device, engineered, iGEM 2011).
The first step consists in the design of the synthetic operon devoted to curli overproduction in response to metal, and therefore in increasing the adherence abilities of the wild type strain. The original curli operon was modified in silico in order to optimize transcriptional and translational signals and escape the "natural" regulation of curli. This approach allowed to test with success our current understanding of curli production. Moreover, simplifying the curli regulation by switching the endogenous complex promoter (more than 10 transcriptional regulators identified) to a simple metal-regulated promoter makes adherence much easier to control.
The second step includes qualitative and quantitative assessment of adherence abilities by implementation of simple methods. These methods are applicable to a large range of adherent bacteria regardless of biological structures involved in biofilm formation. Adherence test in 24-well polystyrene plates provides a quick preliminary visualization of the bacterial biofilm after crystal violet staining. This qualitative test can be sharpened by the quantification of the percentage of adherence. Such a method is very simple but more accurate than only crystal violet staining as described previously 1 with both a good repeatability and reproducibility. Visualization of GFP-tagged bacteria on glass slides by fluorescence or laser confocal microscopy allows to strengthen the results obtained with the 24-well plate test by direct observation of the phenomenon.

The design of a synthetic operon encoding both the secretory apparatus and the structural monomers of curli fibers is described. Overproduction of these amyloids and adherent polymers allows a measurable gain of adherence of the E. coli chassis1. Easy ways to visualize and quantify adherence are explained.

Ingegneria batteri aderenti mediante la creazione di un unico sintetico curli Operon

The  method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of  curli genes under the control of a ...

Ricerca

Bioingegneria

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the concentration of specific chemoeffectors by comparing the current concentration to the concentration detected a few seconds earlier. This comparison determines the net direction of movement. Although multiple, competing gradients often coexist in nature, conventional approaches for investigating bacterial chemotaxis are suboptimal for quantifying migration in response to concentration gradients of attractants and repellents. Here, we describe the development of a microfluidic chemotaxis model for presenting precise and stable concentration gradients of chemoeffectors to bacteria and quantitatively investigating their response to the applied gradient. The device is versatile in that concentration gradients of any desired absolute concentration and gradient strength can be easily generated by diffusive mixing. The device is demonstrated using the response of Escherichia coli RP437 to gradients of amino acids and nickel ions.

This protocol describes the development of a microfluidic device for investigating bacterial chemotaxis in stable concentration gradients of chemoeffectors.

Un dispositivo a microfluidi per quantificare chemiotassi batterica in gradienti di concentrazione stabile

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

Biologia

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility provides X. fastidiosa a means for long-distance intra-plant movement and colonization, contributing toward pathogenicity in X. fastidiosa. The twitching motility of X. fastidiosa is operated by type IV pili. Type IV pili of Xylella fastidiosa are regulated by pilG, a chemotaxis regulator in Pil-Chp operon encoding proteins that are involved with signal transduction pathways. To elucidate the roles of pilG in the twitching motility of X. fastidiosa, a pilG-deficient mutant Xf&#916;pilG and its complementary strain Xf&#916;pilG-C containing native pilG were developed. A microfluidic chambers integrated with a time-lapse image recording system was used to observe twitching motility in Xf&#916;pilG, Xf&#916;pilG-C and its wild type strain. Using this recording system, it permits long-term spatial and temporal observations of aggregation, migration of individual cells and populations of bacteria via twitching motility. X. fastidiosa wild type and complementary Xf&#916;pilG-C strain showed typical twitching motility characteristics directly observed in the microfluidic flow chambers, whereas mutant Xf&#916;pliG exhibited the twitching deficient phenotype. This study demonstrates that pilG contributes to the twitching motility of X. fastidiosa. The microfluidic flow chamber is used as a means for observing twitching motility.

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

In this study, a nano-microfluidic flow chamber was employed to visualize and functionally characterize the twitching motility of Xylella fastidiosa, a bacterium that causes Pierce&#39;s disease in grapevine.

Visualizzazione di Spasmi motilità e caratterizzazione del ruolo del<em&gt; Pell</em&gt; in<em&gt; Fastidiosa Xylella</em

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility ...

Immunologia e infezioni

Single-Molecule Analysis of Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motors

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved single-molecule studies and has gained immense popularity in detecting and understanding the dynamic behavior of fluorescent-tagged molecules. Here, we describe a detailed method for&#160;in vitro single-molecule studies of kinesin-3 family motors using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy. Kinesin-3 is a large family that plays critical roles in cellular and physiological functions ranging from intracellular cargo transport to cell division to development. We have shown previously that constitutively active dimeric kinesin-3 motors exhibit fast and superprocessive motility with high microtubule affinity at the single-molecule level using cell lysates prepared by expressing motor in mammalian cells. Our lab studies kinesin-3 motors and their regulatory mechanisms using cellular, biochemical and biophysical approaches, and such studies demand purified proteins at a large scale. Expression and purification of these motors using mammalian cells would be expensive and time-consuming, whereas expression in a prokaryotic expression system resulted in significantly aggregated and&#160;inactive protein. To overcome the limitations posed by bacterial purification systems and mammalian cell lysate, we have established a robust Sf9-baculovirus expression system to express and purify these motors. The kinesin-3 motors are C-terminally tagged with 3-tandem fluorescent proteins (3xmCitirine or 3xmCit) that provide enhanced signals and decreased photobleaching. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of Sf9 purified proteins demonstrate that kinesin-3 motors are fast and superprocessive akin to our previous studies using mammalian cell lysates. Other applications using these assays include detailed knowledge of oligomer conditions of motors, specific binding partners paralleling biochemical studies, and their kinetic state.

This study details purification of KIF1A(1-393LZ), a member of kinesin-3 family, using Sf9-baculovirus expression system. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of these purified motors exhibited robust motility properties comparable to motors from mammalian cell lysate. Thus, Sf9-baculovirus system is amenable to express and purify motor protein of interest.

Analisi a singola molecola dei motori della famiglia Kinesin-3 superprocessiva purificata Sf9

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved ...

Biochimica

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process starts by screening for colonies that survive on minimal media, assuming that only Escherichia coli harboring the correct plasmid will be able to thrive in the specific conditions. Since the process of building large genetic circuits, requiring the assembly of many DNA parts, is challenging, circuit components are often distributed between multiple plasmids at different copy numbers requiring the use of several antibiotics. Mutations in the plasmid can destroy transcription of the antibiotic resistance genes and interject with resources management in the cell leading to necrosis. The selected colony is set on a glass-bottom Petri dish and a few focus planes are selected for microscopy tracking in both bright field and fluorescent domains. The protocol maintains the image focus for more than 12 hours under initial conditions that cannot be regulated, creating a few difficulties. For example, dead cells start to accumulate in the lenses' field of focus after a few hours of imaging, which causes toxins to buildup and the signal to blur and decay. Depletion of nutrients introduces new metabolic processes and hinder the desired response of the circuit. The experiment's temperature lowers the effectivity of inducers and antibiotics, which can further damage the reliability of the signal. The minimal media gel shrinks and dries, and as a result the optical focus changes over time. We developed this method to overcome these challenges in Escherichia coli, similar to previous works developing analogous methods for other micro-organisms. In addition, this method offers an algorithm to quantify the total stochastic noise in unaltered and altered cells, finding that the results are consistent with flow analyzer predictions as shown by a similar coefficient of variation (CV).

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

This work presents a microscopy method that allows live imaging of a single cell of Escherichia coli for analysis and quantification of the stochastic behavior of synthetic gene circuits.

Misurazione continua del rumore biologico in Escherichia Coli utilizzando la microscopia time-lapse

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

The Dot/Icm secretion system of Legionella pneumophila is a complex type IV secretion system (T4SS) nanomachine that localizes at the bacterial pole and mediates the delivery of protein and DNA substrates to target cells, a process generally requiring direct cell-to-cell contact. We have recently solved the structure of the Dot/Icm apparatus by cryo-electron tomography (cryo-ET) and showed that it forms a cell envelope-spanning channel that connects to a cytoplasmic complex. Applying two complementary approaches that preserve the native structure of the specimen, fluorescent microscopy in living cells and cryo-ET, allows in situ visualization of proteins and assimilation of the stoichiometry and timing of production of each machine component relative to other Dot/Icm subunits. To investigate the requirements for polar positioning and to characterize dynamic features associated with T4SS machine biogenesis, we have fused a gene encoding superfolder green fluorescent protein to Dot/Icm ATPase genes at their native positions on the chromosome. The following method integrates quantitative fluorescence microscopy of living cells and cryo-ET to quantify polar localization, dynamics, and structure of these proteins in intact bacterial cells. Applying these approaches for studying the Legionella pneumophila T4SS is useful for characterizing the function of the Dot/Icm system and can be adapted to study a wide variety of bacterial pathogens that utilize the T4SS or other types of bacterial secretion complexes.

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Imaging of bacterial cells is an emerging systems biology approach focused on defining static and dynamic processes that dictate the function of large macromolecular machines. Here, integration of quantitative live cell imaging and cryo-electron tomography is used to study Legionella pneumophila type IV secretion system architecture and functions.

Applicazione di Live Cell Imaging e tomografia Cryo-Electron a risolvere le caratteristiche spatiotemporali del sistema di secrezione Legionella pneumophila Dot/Icm

The Dot/Icm secretion system of Legionella pneumophila is a complex type IV secretion system (T4SS) nanomachine that localizes at the bacterial pole and ...

Bioprinting di batteri in matrici di idrogel per lo studio della motilità e della crescita

3D Printing Bacteria to Study Motility and Growth in Complex 3D Porous Media

Bacteria are ubiquitous in complex three-dimensional (3D) porous environments, such as biological tissues and gels, and subsurface soils and sediments. However, the majority of previous work has focused on studies of cells in bulk liquids or at flat surfaces, which do not fully recapitulate the complexity of many natural bacterial habitats. Here, this gap in knowledge is addressed by describing the development of a method to 3D-print dense colonies of bacteria into jammed granular hydrogel matrices. These matrices have tunable pore sizes and mechanical properties; they physically confine the cells, thus supporting them in 3D. They are optically transparent, allowing for direct visualization of bacterial spreading through their surroundings using imaging. As a proof of this principle, here, the capability of this protocol is demonstrated by 3D printing and imaging non-motile and motile Vibro cholerae, as well as non-motile Escherichia coli, in jammed granular hydrogel matrices with varying interstitial pore sizes.

Autore in primo piano: Studio della crescita batterica in matrici 3D di idrogel

This protocol describes a procedure for three-dimensional (3D) printing of bacterial colonies to study their motility and growth in complex 3D porous hydrogel matrices that are more akin to their natural habitats than conventional liquid cultures or Petri dishes.

Batteri della stampa 3D per studiare la motilità e la crescita in complessi supporti porosi 3D

Bacteria are ubiquitous in complex three-dimensional (3D) porous environments, such as biological tissues and gels, and subsurface soils and sediments. ...

Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility

The study of glycosylation in prokaryotes is a rapidly growing area. Bacteria harbor different glycosylated structures on their surface whose glycans constitute a strain-specific barcode. The associated glycans show higher diversity in sugar composition and structure than those of eukaryotes and are important in bacterial-host recognition processes and interaction with the environment. In pathogenic bacteria, glycoproteins have been involved in different stages of the infectious process, and glycan modifications can interfere with specific functions of glycoproteins. However, despite the advances made in the understanding of glycan composition, structure, and biosynthesis pathways, understanding of the role of glycoproteins in pathogenicity or interaction with the environment remains very limited. Furthermore, in some bacteria, the enzymes required for protein glycosylation are shared with other polysaccharide biosynthetic pathways, such as lipopolysaccharide and capsule biosynthetic pathways. The functional importance of glycosylation has been elucidated in several bacteria through mutation of specific genes thought to be involved in the glycosylation process and the study of its impact on the expression of the target glycoprotein and the modifying glycan. Mesophilic Aeromonas have a single and O-glycosylated polar flagellum. Flagellar glycans show diversity in carbohydrate composition and chain length between Aeromonas strains. However, all strains analyzed to date show a pseudaminic acid derivative as the linking sugar that modifies serine or threonine residues. The pseudaminic acid derivative is required for polar flagella assembly, and its loss has an impact on adhesion, biofilm formation, and colonization. The protocol detailed in this article describes how the construction of null mutants can be used to understand the involvement of genes or genome regions containing putative glycosyltransferases in the biosynthesis of a flagellar glycan. This includes the potential to understand the function of the glycosyltransferases involved and the role of the glycan. This will be achieved by comparing the glycan deficient mutant to the wild-type strain.

Here, we describe the construction of null mutants of Aeromonas in specific glycosyltransferases or regions containing glycosyltransferases, the motility assays, and flagella purification performed to establish the involvement and function of their encoded enzymes in the biosynthesis of a glycan, as well as the role of this glycan in bacterial pathogenesis.

Generazione di mutanti nulli per chiarire il ruolo delle glicosiltransferasi batteriche nella motilità batterica

The study of glycosylation in prokaryotes is a rapidly growing area. Bacteria harbor different glycosylated structures on their surface whose glycans ...

Investigare la motilità guidata dalla Flagella in Escherichia coli applicando tre tecniche consolidate in una serie

Riepilogo

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Batteri della stampa 3D per studiare la motilità e la crescita in complessi supporti porosi 3D

Batteri della stampa 3D per studiare la motilità e la crescita in complessi supporti porosi 3D

Batteri della stampa 3D per studiare la motilità e la crescita in complessi supporti porosi 3D

Generazione di mutanti nulli per chiarire il ruolo delle glicosiltransferasi batteriche nella motilità batterica