Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione gm118085 dei National Institutes of Health e in parte dalla Robert Welch Foundation (sovvenzione F-1811 a R.M.H.).

1. Isolamento dei mutanti soppressori in ceppi carenti di motilità
NOTA: Utilizzare questo metodo come un ampio "catch-all" per identificare la natura generale del difetto di motilità.
<ol><li>Preparazione piastra soft-agar NOTA: Soft-agar, noto anche come motilità o agar da bagno, è un agar a bassa percentuale (~0,2-0,35% w/v), a lungo usato per saggiare chemiotassi31,32.<ol>
<li>Aggiungere 3 g di bacto-agar (0,3% w/v) e 20 g di LB in un pallone inferiore rotondo da 2 L. Aggiungere 1 L di ddH2O (acqua a doppia distillazione) al pallone e mescolare uniformemente la sospensione utilizzando un'asta di agitazione e una piastra di agitazione magnetica.</li>
		<li>Autoclave per 20 min a 121 °C.</li>
		<li>Lasciare raffreddare con delicata agitazione utilizzando l'asta / piastra come sopra. Quando la temperatura raggiunge circa 50 °C, versare 25 mL in piastre di Petri sterili (100 mm x 15 mm) e lasciare che l'agar fuso si metta con coperchio in posizione per almeno 1 h, da utilizzare entro 16 ore.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione della cultura, inoculazione e isolamento dei mutanti soppressori NOTA: E. coli inoculato al centro di mezzi ricchi di nutrienti solidificati con agar morbido consumano nutrienti localmente, creando un gradiente nutritivo che seguono. Mentre si spostano verso l'esterno, compaiono "anelli" definiti (Figura 1A), che sono correlati a specifici chemioatattanti a cui i batteri rispondono. Difetti nel sistema chemiotassi o componenti strutturali del motore flagella possono compromettere le prestazioni in questo saggio. Spesso, i mutanti con un vantaggio di motilità sorgono durante lo screening e possono essere visti emergere da singoli o da più punti lungo la periferia dell'anello, da dove "divampano"(Figura 1C). Si noterà che il bordo più esterno del fronte di nuoto contrasta prontamente con l'agar morbido vergine non colato.<ol>
<li>Coltivare colture notturne del ceppo desiderato carente di motilità in 5 mL di Brodo di Lennox (LB; 10 g/L di triptono, 5 g/L di estratto di lievito e 5 g/L NaCl, Tabella dei Materiali)a 30 °C con scuotimento orizzontale (220 r.p.m.). Il giorno seguente, la sottocultura (diluizione 1:100) in LB fresco, crescendo nelle stesse condizioni fino alla fase esponenziale (OD600 di 0,6).</li>
		<li>Inoculare 6 μL della coltura al centro di una piastra di agar morbido (1.1) utilizzando una pipetta, spingendo la punta sterile caricata nell'agar per espellere delicatamente il contenuto. Trasferimento a 30 °C e incubare (Figura 1B), fino a quando i "brillamenti" di motilità sono evidenti, emanando dal punto di inoculazione o dalla periferia degli anelli di motilità, tipicamente in 24-36 h(Figura 1C). NOTA: Nei saggi di motilità, inoculare un ceppo di tipo selvatico insieme agli isolati mutanti per il confronto. Questo ceppo di tipo selvatico mostrerà i caratteristici anelli chemiotattici concentrici(Figura 1A)e riempirà la piastra entro 8-10 ore.</li>
		<li>Utilizzare un filo-loop sterile per sollevare le cellule dalla regione e dalla striscia "flare" per purificare singole colonie su una piastra di agar duro LB (LB preparata come sopra, solidificata con bacto-agar da 15 g/L).</li>
		<li>Scegli singole colonie dalla piastra di striscia usando un anello di filo sterile e purificale striature per singole colonie per garantire l'isolamento di una colonia "pura" isolata.</li>
	</ol></li>
	<li>Conferma e caratterizzazione dei mutanti soppressori
	<ol>
<li>Verificare che i mutanti soppressori isolati abbiano ripristinato la motilità. Preparare piastre di agar morbido (1.1) e colture per ceppi di interesse (come al punto 1.2.1), compresi i tipi selvatici e il ceppo iniziale "carente di motilità" per il confronto.</li>
		<li>Inoculare le piastre (come in 1.2.2) e incubare a 30 °C per 8-10 h.</li>
		<li>Registrare il diametro dell'anello più esterno (bordo del cerchio) e confrontare per stabilire quale degli isolati ha sostanzialmente ripristinato la motilità. NOTA: Si raccomanda di fotografare le lastre durante tutto il corso del tempo dell'esperimento. Per ottenere i migliori risultati, utilizzare un dispositivo "secchiello diluce" 30, in cui una fotocamera digitale è montata sopra una sorgente luminosa per una migliore illuminazione per misurare il diametro della colonia di nuoto e distinguerla dall'agar non raggruppato.</li>
		<li>Soggetto isolato in WGS come richiesto, consentendo una sufficiente "copertura della sequenza" per identificare positivamente le mutazioni che hanno ripristinato la funzione di tipo selvaggio.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Quantificare il comportamento motorio della flagella tramite il tethering cellulare
NOTA: utilizzare questo metodo quando il normale comportamento run-tumble (chemiotaxis) sembra essere compromesso.
<ol><li>
Preparazione della cultura e tosatura della flagella
	<ol>
<li>Preparare una cultura di fase esponenziale del ceppo di interesse come descritto al passaggio 1.2.1.</li>
		<li>Pellet 10 mL di cellule per centrifugazione a 2.000 x g per 3 minuti prima di rimescolare in 10 mL di Motiliity Buffer sterilizzato con filtro (MB; Tampone fosfato di potassio da 10 mM [0,0935 M K2HPO4, 0,0065 M KH2PO4, pH 7,0], 0,1 mM EDTA [pH 7,0], NaCl da 10 mM, 75 mM KCl). NOTA: MB supporta la motilità, ma non supporta la crescita batterica</li>
		<li>Ripetere il passaggio 2.1.2 altre due volte prima di rimospendere il pellet finale in 1 mL di MB.</li>
		<li>Trasferire la sospensione cellulare in una siringa da 1 ml e attaccare un ago 23G all'estremità. Assemblare un identico apparato siringa/ago e fissare i due insieme tramite 6 pollici di tubi di polietilene (diametro interno di 0,58 mm) strettamente infilati su ogni punta dell'ago.</li>
		<li>Tosare la flagella (sono fragili e si rompono facilmente) passando delicatamente la sospensione cellulare avanti e indietro da una siringa all'altra 50x, con 1 min di pausa tra ogni 10 passaggi.</li>
		<li>Centrifugare le cellule tranciate a 2.000 x g per 3 minuti e rimombidare in un volume finale di 500 μL di MB.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione delle diapositive e tethering cellulare
	<ol>
<li>Preparare una camera di fissazione delle celle impilando un coverslip da 18 mm x 18 mm su uno scivolo da microscopio in vetro da 3 pollici x 1 pollice x 1 mm, separato da nastro a doppia parte (Figura S1).</li>
		<li>Sciacquare la camera con soluzione di polilisina 0,01% (w/v) applicandosi sulla parte superiore della camera. Inclinare il bordo inferiore (il coverslip flush con lo scivolo del microscopio) su un tergicristallo (carta velina) per aiutare a disegnare la soluzione attraverso la camera (Figura S1). Quindi incubare a temperatura ambiente per 10 minuti.</li>
		<li>Lavare la camera tre volte con 40 μL di MB utilizzando come descritto al passaggio 2.2.2</li>
		<li>Aggiungere 40 μL della sospensione cellulare tranciata (preparata sopra) nella parte superiore della camera e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti per consentire alle cellule di attaccarsi al coperchio.</li>
		<li>Sciacquare delicatamente la camera con 40 μL di MB come in 2.2.3 per rimuovere le celle non attaccate.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Registrazione e quantificazione della rotazione cellulare
	<ol>
<li>Trasferire lo scivolo del microscopio caricato con celle tethered allo stadio del microscopio.</li>
		<li>Utilizzando la microscopia a contrasto di fase e un obiettivo 100x, scansionare la popolazione alla ricerca di cellule fissate in posizione e ruotare su un singolo asse, o cioè rotazioni lisce su un punto fisso piuttosto che presentarsi con un angolo in cui la cella si muove in uscita e fuori fuoco (Video 1).</li>
		<li>Utilizzare un microscopio commerciale e la fotocamera associata. Aprire il software associato, assicurarsi che le celle di interesse siano a fuoco e fare clic sull'acquisizione video per registrare la rotazione delle celle per un minuto (a 10 fotogrammi al secondo o superiore).</li>
		<li>Dalla riproduzione video, quantificare il numero di rotazioni complete al minuto e il numero di volte in cui la cella cambia direzione (frequenza di commutazione). NOTA: Le velocità di rotazione e la frequenza di commutazione possono essere troppo veloci per essere misurate a occhio, quindi si consiglia di utilizzare un software video che offre una riproduzione lenta / fine o adotta un sistema software automatizzato per quantificare i patternrotazionali 33. Un'alternativa sarebbe aumentare la viscosità dell'MB usando la cellulosa metile (o agente simile) per aiutare a rallentare e risolvere la rotazione di batteri più veloci o compensare quando sono in uso telecamere con bassi framerate.</li>
		<li>Ripetere il passaggio 2.3.2 con repliche biologiche per compilare una rappresentazione della popolazione di interesse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Preparazione di sciami in un saggio di attraversamento della frontiera
NOTA: Utilizzare questo metodo per valutare l'impatto di una mutazione o condizione sulla motilità di gruppo. Swarm-agar si riferisce all'agar dove la percentuale è tipicamente superiore a quella di soft-agar. Nell'agar morbido (0,3 %), le cellule nuotano individualmente all'interno dell'agar. Nell'agar dello sciame (0,5% e oltre), le cellule si muovono come gruppo sulla superficie. Mentre le piastre dello sciame devono essere utilizzate come descritto in dettaglio qui, le piastre da bagno hanno una durata di conservazione più lunga e possono essere utilizzate per diversi giorni. La nostra preferenza personale è da utilizzare in 1-2 giorni.
<ol><li>
Preparazione dell'agar sciame
	<ol>
<li>Aggiungere 5 g di agar Eiken (0,5% w/v) e 20 g di LB in un pallone inferiore rotondo da 2 L. Aggiungere 1 L di ddH2O al pallone e mescolare uniformemente la sospensione utilizzando un'asta di agitazione e una piastra di agitazione magnetica.</li>
		<li>Autoclave per 20 min a 121 °C.</li>
		<li>Lasciare raffreddare con delicata agitazione per evitare bolle d'aria utilizzando l'asta / piastra come sopra. Quando si aggiungono circa 50 °C, aggiungere glucosio sterilizzato con filtro per una concentrazione finale dello 0,5 %.</li>
		<li>Versare 25 mL in piastre di Petri sterili (100 mm x 15 mm) e lasciare impostare a temperatura ambiente per almeno 14 ore e non più di 20 ore. Non conservare per un uso futuro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Inoculazione e incubazione di piastre sciame
	<ol>
<li>Inoculare 6 μL di una coltura medio-esponenziale (preparata come in 1,2) individuando sopra l'agar.</li>
		<li>Lasciare il coperchio spento per 5-10 minuti e sostituire quando l'inoculo si è asciugato nella superficie dell'agar.</li>
		<li>Incubare a 30 °C per 8 ore. Evita la tentazione di ispezionare i progressi dello sciame rimuovendo il coperchio, in quanto ciò contribuirà all'asciugatura dell'agar e compromette lo sciame. NOTA: Il tempo di incubazione può variare a seconda del fenotipo di deformazione. Alcune mutazioni isolate possono ostacolare la capacità di sciame e richiederanno una ridotta percentuale di agar o un periodo di incubazione più prolungato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione di targhe di dosaggio transfrontaliere NOTA: Questo saggio utilizza una piastra di Petri modificata, in cui una divisione di plastica (bordo) crea due camere, anziché una (Figura 2A). Ogni camera può essere preparata indipendentemente dall'altra, offrendo condizioni diverse per lo sciame, prima di "collegare" le due. A seconda del design sperimentale, la prima camera (designata a sinistra) può essere preparata con agar da bagno (0,3% w/v) o agar sciame (0,5% w/v) da cui i batteri possono migrare attraverso il confine nella camera destra contenente agar sciame +/- qualsiasi integratore o sfida richiesta (ad esempio, antibiotici). La migrazione su entrambi gli agar viene tipicamente misurata/confrontata registrando il diametro più ampio della colonizzazione batterica (da bordo a bordo) dal punto originale di inoculazione.<ol>
<li>Preparare l'agar da bagno come descritto al punto 1.1, se necessario.</li>
		<li>Preparare l'agar dello sciame come descritto al punto 3.1.</li>
		<li>Versare ~30 mL di agar sciame (con l'integrazione desiderata se necessario) nella camera destra di una piastra di Petri a doppio compartimento (100 mm x 15 mm), al punto in cui è livellata con il divisore di plastica tra le camere, ma non traboccante a sinistra(Figura 2B).</li>
		<li>Dopo che l'agar si è indurito, riempire la camera sinistra con ~ 30 mL di agar da bagno o sciame, di nuovo al punto di contatto con il diviso di plastica(Figura 2C). Prima di impostarlo, utilizzare una punta sterile per trascinare delicatamente l'agar oltre il bordo per collegare i due lati con un ponte di agar alto ~ 1 mm che si estende per l'intera lunghezza della divisione (Figura 2D).</li>
		<li>Lasciare asciugare la piastra a temperatura ambiente (3.1). NOTA: Un metodo alternativo per creare il ponte è consentire all'agar della camera sinistra di asciugarsi e quindi pipettare lentamente ~ 100 μL di agar sciame fuso lungo il divisore di plastica per collegare le due camere (3.4). Inoculare le piastre sulla camera sinistra come sopra dettagliato per nuotare (1.2.2) o sciame (3.2) agar, prima di incubare a 30 °C per 12-16 ore, o fino a quando gli sciami non hanno fatto progressi sufficienti sulla camera destra per consentire confronti tra ceppi di interesse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L'isolamento e la caratterizzazione delle mutazioni soppressori hanno contribuito con successo all'identificazione dei componenti chiave del sistema chemiotassi35,36,37,nonché della macchina motorestessa 38,39,40. Durante l'utilizzo del protocollo 1, è importante includere più repliche indipendenti per garantire l'isolamento di un am...

I batteri impiegano molte appendici per il movimento e la dispersione nelle loro nicchie ecologiche1. La motilità guidata dalla flagella è la più veloce di queste, promuovendo la colonizzazione di località favorevoli in risposta ai segnali ambientali e contribuendo in modo significativo alla capacità patogena di alcunespecie 2,3. I batteri flagellati possono nuotare individualmente in liquido sfuso o sciamare collettivamente su una superficie semi-solida4. La flagella extracellulare si attacca e viene guidata da motori rotanti incorporati nella membrana, che sfruttano la potenza dei gradienti ionici per generare coppia che causala rotazione 1,2,4,5,6,7,8. In E. coli, i cui motori funzionano a una coppia costante 9 , l'uscita del motore può essere classificata in termini di velocità di rotazione e commutazione del rotore tra direzioni antiorario (CCW) e in senso orario (CW). La rotazione CCW promuove la formazione di un fascio flagellare coerente che spinge la cella in avanti (corsa), mentre un interruttore transitorio in direzione rotazionale (CW) fa sì che il fascio si smonti parzialmente o completamente10e la cella riorienti la sua direzione di nuoto (tumble). E. coli in genere corre per un secondo e cade per un decimo di secondo. La frequenza di commutazione del rotore o "tumble bias" è controllata dal sistema di segnalazione chemiotassi, in cui i chemorecettori transmembrana rilevano segnali chimici esterni e li trasmettono tramite fosforelay al motore flagellare per estendere le corse in risposta agli attrattori, o sopprimerle in risposta asostanze chimiche tossiche 11,12. La motilità del nuoto viene saggiata in un agar morbido dello 0,3%.
Durante lo sciame, i batteri navigano su una superficie semi-solida come un collettivo denso, dove branchi di batteri srotoleggiano in un movimento vorticosocontinuo 2,13,14,15. Gli sciami di E. coli mostrano una fisiologia chemiosensoriale alterata (distorsione della caduta inferiore), velocità più elevate e maggiore tolleranza agli antimicrobici sulle cellule che nuotano nel liquido sfuso16,17. Gli sciami variano nella loro implementazione di una pletora di strategie che aiutano il movimento, tra cui la produzione di tensioattivi, l'iperflagellazione e l'allungamento cellulare2. Lo sciame offre ai batteri un vantaggio competitivo sia in contesti ecologici checlinici 18,19,20. Ci sono due categorie di batteri brulicanti: sciami temperati, che possono sciamare solo su supporti solidificati con agar 0,5-0,8%, e sciami robusti, che possono navigare attraverso concentrazioni di agar piùelevate 21.
Esistono una varietà di saggi per interrogare la motilità del nuoto e la sua regolazione. Se compromessa da mutazioni o condizioni ambientali, la motilità stessa offre una forte selezione per identificare le mutazioni soppressori del guadagno di funzione. Questi soppressori possono essere veri revertanti della mutazione originale, o pseudo-revertanti, dove una seconda mutazione ripristina la funzionalità. Tali mutanti possono essere identificati dal sequenziamento dell'intero genoma (WGS). Un'alternativa alla selezione imparziale del soppressore è una strategia di mutagenesi mirata distorta (ad esempio, mutagenesi PCR). Queste metodologie spesso fanno luce sulla funzione o sulla regolazione ambientale dell'apparato di motilità. Se l'obiettivo è quello di studiare la funzione motoria, allora il ripristino della motilità di tipo selvaggio misurata in agar morbido potrebbe non indicare necessariamente il ripristino della produzione motoria di tipo selvaggio. Il saggio di tethering cellulare, in cui le cellule sono attaccate a una superficie di vetro da un singolo flagello e la rotazione del corpo cellulare viene successivamente monitorata, può essere il saggio iniziale di scelta per valutare il comportamento motorio. Sebbene siano ora disponibili metodologie più sofisticate per monitorare le proprietà del motore, la necessaria configurazione e applicazione di pacchetti software per l'analisi del movimento limita il loro usodiffuso 22,23,24,25. Il saggio di tethering cellulare richiede solo che la flagella sia tranciata, consentendo l'attacco dei filamenti corti a uno scivolo di vetro, seguito da una videoregistrazione della rotazione del corpo cellulare. Sebbene le velocità motorie registrate siano basse in questo saggio a causa dell'elevato carico che il corpo cellulare esercita sul flagello, questo saggio ha comunque contribuito a preziose intuizioni sulle risposte chemiotattiche26,27,28,29e rimane un valido strumento investigativo come discusso di seguito.
La motilità brulicante pone una serie diversa di sfide ai ricercatori. La selezione dei soppressori di guadagno di funzione funziona solo in sciami che producono abbondanti tensioattivi e sciamiprontamente 13. I non produttori tensioattivi come E. coli sono esigenti per quanto riguarda la scelta dell'agar, la composizione dei media e l'umiditàdell'ambiente 2,13,14,21. Una volta stabilite le condizioni di sciame, il saggio di attraversamento dellafrontiera 17 è una metodologia utile per interrogare la capacità di uno sciame di navigare in condizioni nuove / difficili. Sebbene i protocolli presentati di seguito riguardino E. coli, possono essere facilmente adattati per l'applicazione in altre specie.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto Dehydrated Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0140-15-4</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Disodium Salt, Dihydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-002-786</td><td></td></tr><tr><td>Eiken agar</td><td>Eiken Chemical Co. Japan</td><td>E-MJ00</td><td>Essential for E. coli swarming</td></tr><tr><td>Glucose D (+)</td><td>Fisher Scientific</td><td>410955000</td><td></td></tr><tr><td>LB (Lennox) Broth</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine Solution (0.1%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-605-496</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate monobasic (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate dibasic (K2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials and Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellSense microscope imaging software (V. 1.6)</td><td>Olympus</td><td></td><td>Or equivalent software for microscope used</td></tr><tr><td>Electron Microscopy Sciences Scotch 666 Doube Sided Tape</td><td>Fisher</td><td>50-285-28</td><td></td></tr><tr><td>Frosted microscope slides 3x1x1mm</td><td>Fisher</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX53 microscope</td><td>Olympus</td><td>BX53</td><td>Any upright or inverted phase microscope can be used</td></tr><tr><td>Petri dishes (100 mm diameter)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>For soft-agar assays</td></tr><tr><td>Polyethylene Nebulizer Capillary Tubing (0.58mm x 99mm 3.0m)</td><td>Perkin Elmer</td><td>9908265</td><td></td></tr><tr><td>Round Petri Dish with 2 Compartments</td><td>VWR</td><td>89200-944</td><td>For border-crossing assays</td></tr><tr><td>Safety Hypodermic Needles (23G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826A</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Syringe - 1 mL</td><td>Fisher scientific</td><td>14-955-450</td><td></td></tr><tr><td>Task/Tissue wipes</td><td>Fisher scientific</td><td>06-666</td><td>Or equivalent single use tissue wipes</td></tr><tr><td>VWR micro cover-glass 18x18mm</td><td>VWR</td><td>48366205</td><td></td></tr><tr><td>XM10 camera</td><td>Olympus</td><td>XM10</td><td>Or equivalent microscope camera</td></tr></tbody></table>

investigating flagella-driven motility in escherichia coli by applying three established techniques in a series

La motilità è fondamentale per la sopravvivenza e il successo di molte specie batteriche. Esistono molte metodologie per sfruttare la motilità per comprendere i percorsi di segnalazione, per chiarire la funzione e l'assemblaggio delle parti flagellari e per esaminare e comprendere i modelli di movimento. Qui dimostriamo una combinazione di tre di queste metodologie. La motilità nell'agar morbido è la più antica, offrendo una forte selezione per isolare le mutazioni soppressori del guadagno di funzione nei ceppi compromessi dalla motilità, dove la motilità viene ripristinata attraverso una seconda mutazione. La tecnica di tethering cellulare, utilizzata per la prima volta per dimostrare la natura rotante del motore flagellare, può essere utilizzata per valutare l'impatto degli effettori di segnalazione sulla velocità del motore e la sua capacità di cambiare direzione rotazionale. Il saggio "border-crossing" è più recente, dove i batteri del nuoto possono essere innescati per passare a muoversi collettivamente come uno sciame. In combinazione, questi protocolli rappresentano un approccio sistematico e potente per identificare i componenti del macchinario di motilità e per caratterizzare il loro ruolo in diverse sfaccettature del nuoto e dello sciame. Possono essere facilmente adattati per studiare la motilità in altre specie batteriche.

L'isolamento degli pseudo-revertanti in un ceppo E. coli la cui motilità è compromessa da alti livelli della molecola di segnalazione c-di-GMP, è stato descritto in recente lavoro del nostro laboratorio34. Questo ceppo (JP1442) ha ospitato due mutazioni: ΔyhjH e ΔycgR. YhjH è la fosfodiesterasi più attiva che degrada il c-di-GMP in E. coli. L'assenza di YhjH porta ad elevati livelli di c-di-GMP e all'inibizione della motilità. YcgR è un effettore c-di-G...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series at JoVE.com

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Molti batteri usano la motilità guidata dalla flagella per navigare nel loro ambiente e colonizzare un ambiente favorevole sia individualmente che collettivamente. Qui è dimostrato l'uso di tre metodi consolidati che sfruttano la motilità come strumento di selezione per identificare componenti / percorsi che contribuiscono al nuoto e alla motilità brulicante.

Investigare la motilità guidata dalla Flagella in Escherichia coli applicando tre tecniche consolidate in una serie

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, ...

investigating-flagella-driven-motility-escherichia-coli-applying

Research

JoVE Journal

Biology

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

7.5K Views.  The University of Texas at Austin. Molti batteri usano la motilità guidata dalla flagella per navigare nel loro ambiente e colonizzare un ambiente favorevole sia individualmente che collettivamente. Qui è dimostrato l'uso di tre metodi consolidati che sfruttano la motilità come strumento di selezione per identificare componenti / percorsi che contribuiscono al nuoto e alla motilità brulicante.

Video: Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature

We present a method for using temperature to tune the flow speeds of kinesin-driven, microtubule-based three-dimensional (3D) active fluids. This method allows for tuning the speeds in situ without the need to manufacture new samples to reach different desired speeds. Moreover, this method enables the dynamic control of speed. Cycling the temperature leads the fluids to flow fast and slow, periodically. This controllability is based on the Arrhenius characteristic of the kinesin-microtubule reaction, demonstrating a controlled mean flow speed range of 4&#8211;8 &#181;m/s. The presented method will open the door to the design of microfluidic devices where the flow rates in the channel are locally tunable without the need for a valve.

The goal of this protocol is to use temperature to control the flow speeds of three-dimensional active fluids. The advantage of this method not only allows for regulating flow speeds in situ but also enables dynamic control, such as periodically tuning flow speeds up and down.

Controllo delle velocità di flusso dei fluidi attivi 3D basati su microtubuli utilizzando la temperatura

We present a method for using temperature to tune the flow speeds of kinesin-driven, microtubule-based three-dimensional (3D) active fluids. This method ...

Ricerca

Ingegneria

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the concentration of specific chemoeffectors by comparing the current concentration to the concentration detected a few seconds earlier. This comparison determines the net direction of movement. Although multiple, competing gradients often coexist in nature, conventional approaches for investigating bacterial chemotaxis are suboptimal for quantifying migration in response to concentration gradients of attractants and repellents. Here, we describe the development of a microfluidic chemotaxis model for presenting precise and stable concentration gradients of chemoeffectors to bacteria and quantitatively investigating their response to the applied gradient. The device is versatile in that concentration gradients of any desired absolute concentration and gradient strength can be easily generated by diffusive mixing. The device is demonstrated using the response of Escherichia coli RP437 to gradients of amino acids and nickel ions.

This protocol describes the development of a microfluidic device for investigating bacterial chemotaxis in stable concentration gradients of chemoeffectors.

Un dispositivo a microfluidi per quantificare chemiotassi batterica in gradienti di concentrazione stabile

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

Biologia

Quantifying Bacterial Surface Swarming Motility on Inducer Gradient Plates

Bacterial swarming motility is a common microbiological phenotype that bacterial communities use to migrate over semisolid surfaces. In investigations of induced swarming motility, specific concentration&#160;of an inducer may not be able to report events occurring within the optimal concentration range to elicit the desired responses from a species. Semisolid plates containing multiple concentrations are commonly used to investigate the response within an inducer concentration range. However, separate semisolid plates increase variations in medium viscosity and moisture content within each plate due to nonuniform solidification time.
This paper describes a one-step method to simultaneously test surface swarming motility on a single gradient plate, where the isometrically arranged test wells allow the simultaneous acquisition of multiconcentration responses. In the present work, the surface swarming of Escherichia coli K12 and Pseudomonas aeruginosa PAO1 were evaluated in response to a concentration gradient of inducers such as resveratrol and arabinose. Periodically, the swarm morphologies were imaged using an imaging system to capture the entire surface swarming process.
The quantitative measurement of the swarm morphologies was acquired using ImageJ software, providing analyzable information of the swarm area. This paper presents a simple gradient swarm plate method that provides qualitative and quantitative information about the inducers&#39; effects on surface swarming, which can be extended to study the effects of other inducers on a broader range of motile bacterial species.

Here, we describe the use of inducer gradient plates to evaluate bacterial swarming motility while simultaneously obtaining multiple concentration responses.

Quantificazione della motilità dello sciame di superficie batterica su piastre gradienti induttori

Bacterial swarming motility is a common microbiological phenotype that bacterial communities use to migrate over semisolid surfaces. In investigations of ...

Biochimica

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility provides X. fastidiosa a means for long-distance intra-plant movement and colonization, contributing toward pathogenicity in X. fastidiosa. The twitching motility of X. fastidiosa is operated by type IV pili. Type IV pili of Xylella fastidiosa are regulated by pilG, a chemotaxis regulator in Pil-Chp operon encoding proteins that are involved with signal transduction pathways. To elucidate the roles of pilG in the twitching motility of X. fastidiosa, a pilG-deficient mutant Xf&#916;pilG and its complementary strain Xf&#916;pilG-C containing native pilG were developed. A microfluidic chambers integrated with a time-lapse image recording system was used to observe twitching motility in Xf&#916;pilG, Xf&#916;pilG-C and its wild type strain. Using this recording system, it permits long-term spatial and temporal observations of aggregation, migration of individual cells and populations of bacteria via twitching motility. X. fastidiosa wild type and complementary Xf&#916;pilG-C strain showed typical twitching motility characteristics directly observed in the microfluidic flow chambers, whereas mutant Xf&#916;pliG exhibited the twitching deficient phenotype. This study demonstrates that pilG contributes to the twitching motility of X. fastidiosa. The microfluidic flow chamber is used as a means for observing twitching motility.

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

In this study, a nano-microfluidic flow chamber was employed to visualize and functionally characterize the twitching motility of Xylella fastidiosa, a bacterium that causes Pierce&#39;s disease in grapevine.

Visualizzazione di Spasmi motilità e caratterizzazione del ruolo del<em&gt; Pell</em&gt; in<em&gt; Fastidiosa Xylella</em

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility ...

Immunologia e infezioni

Reconstitution of Actin-Based Motility with Commercially Available Proteins

Many cell movements and shape changes and certain types of intracellular bacterial and organelle motility are driven by the biopolymer actin that forms a dynamic network at the surface of the cell, organelle, or bacterium. The biochemical and mechanical basis of force production during this process can be studied by reproducing actin-based movement in an acellular manner on inert surfaces such as beads that are functionalized and incubated with a controlled set of components. Under the appropriate conditions, an elastic actin network assembles at the bead surface and breaks open due to the stress generated by network growth, forming an "actin comet" that propels the bead forward. However, such experiments require the purification of a host of different actin-binding proteins, often putting them beyond the reach of non-specialists. This article details a protocol for reproducibly obtaining actin comets and motility of beads using commercially available reagents. Bead coating, bead size, and motility mixture can be altered to observe the effect on bead speed, trajectories, and other parameters. This assay can be used for testing the biochemical activities of different actin-binding proteins, and for performing quantitative physical measurements that shed light on active matter properties of actin networks. This will be a useful tool for the community, enabling the study of in vitro actin-based motility without expert knowledge in actin-binding protein purification.

This protocol describes how to produce actin comets on the surfaces of beads using commercially available protein ingredients. Such systems mimic the protrusive structures found in cells, and can be used to examine physiological mechanisms of force production in a simplified way.

Ricostituzione della motilità a base di actina con proteine disponibili in commercio

Many cell movements and shape changes and certain types of intracellular bacterial and organelle motility are driven by the biopolymer actin that forms a ...

Bioingegneria

Bioprinting di batteri in matrici di idrogel per lo studio della motilità e della crescita

3D Printing Bacteria to Study Motility and Growth in Complex 3D Porous Media

Bacteria are ubiquitous in complex three-dimensional (3D) porous environments, such as biological tissues and gels, and subsurface soils and sediments. However, the majority of previous work has focused on studies of cells in bulk liquids or at flat surfaces, which do not fully recapitulate the complexity of many natural bacterial habitats. Here, this gap in knowledge is addressed by describing the development of a method to 3D-print dense colonies of bacteria into jammed granular hydrogel matrices. These matrices have tunable pore sizes and mechanical properties; they physically confine the cells, thus supporting them in 3D. They are optically transparent, allowing for direct visualization of bacterial spreading through their surroundings using imaging. As a proof of this principle, here, the capability of this protocol is demonstrated by 3D printing and imaging non-motile and motile Vibro cholerae, as well as non-motile Escherichia coli, in jammed granular hydrogel matrices with varying interstitial pore sizes.

Autore in primo piano: Studio della crescita batterica in matrici 3D di idrogel

This protocol describes a procedure for three-dimensional (3D) printing of bacterial colonies to study their motility and growth in complex 3D porous hydrogel matrices that are more akin to their natural habitats than conventional liquid cultures or Petri dishes.

Batteri della stampa 3D per studiare la motilità e la crescita in complessi supporti porosi 3D

Bacteria are ubiquitous in complex three-dimensional (3D) porous environments, such as biological tissues and gels, and subsurface soils and sediments. ...

Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility

The study of glycosylation in prokaryotes is a rapidly growing area. Bacteria harbor different glycosylated structures on their surface whose glycans constitute a strain-specific barcode. The associated glycans show higher diversity in sugar composition and structure than those of eukaryotes and are important in bacterial-host recognition processes and interaction with the environment. In pathogenic bacteria, glycoproteins have been involved in different stages of the infectious process, and glycan modifications can interfere with specific functions of glycoproteins. However, despite the advances made in the understanding of glycan composition, structure, and biosynthesis pathways, understanding of the role of glycoproteins in pathogenicity or interaction with the environment remains very limited. Furthermore, in some bacteria, the enzymes required for protein glycosylation are shared with other polysaccharide biosynthetic pathways, such as lipopolysaccharide and capsule biosynthetic pathways. The functional importance of glycosylation has been elucidated in several bacteria through mutation of specific genes thought to be involved in the glycosylation process and the study of its impact on the expression of the target glycoprotein and the modifying glycan. Mesophilic Aeromonas have a single and O-glycosylated polar flagellum. Flagellar glycans show diversity in carbohydrate composition and chain length between Aeromonas strains. However, all strains analyzed to date show a pseudaminic acid derivative as the linking sugar that modifies serine or threonine residues. The pseudaminic acid derivative is required for polar flagella assembly, and its loss has an impact on adhesion, biofilm formation, and colonization. The protocol detailed in this article describes how the construction of null mutants can be used to understand the involvement of genes or genome regions containing putative glycosyltransferases in the biosynthesis of a flagellar glycan. This includes the potential to understand the function of the glycosyltransferases involved and the role of the glycan. This will be achieved by comparing the glycan deficient mutant to the wild-type strain.

Here, we describe the construction of null mutants of Aeromonas in specific glycosyltransferases or regions containing glycosyltransferases, the motility assays, and flagella purification performed to establish the involvement and function of their encoded enzymes in the biosynthesis of a glycan, as well as the role of this glycan in bacterial pathogenesis.

Generazione di mutanti nulli per chiarire il ruolo delle glicosiltransferasi batteriche nella motilità batterica

The study of glycosylation in prokaryotes is a rapidly growing area. Bacteria harbor different glycosylated structures on their surface whose glycans ...

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar and sometimes inclusion of specific nutrients in the growth medium. The preparation of such explicit media and surface growth conditions serves to provide the favorable conditions that allow not just bacterial growth but coordinated motility of bacteria over these surfaces within thin liquid films. Reproducibility of swarm plate and other surface motility plate assays can be a major challenge. Especially for more &#8220;temperate swarmers&#8221; that exhibit motility only within agar ranges of 0.4%-0.8% (wt/vol), minor changes in protocol or laboratory environment can greatly influence swarm assay results. &#8220;Wettability&#8221;, or water content at the liquid-solid-air interface of these plate assays, is often a key variable to be controlled. An additional challenge in assessing swarming is how to quantify observed differences between any two (or more) experiments. Here we detail a versatile two-phase protocol to prepare and image swarm assays. We include guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay media preparation and quantification of data from these assays. We specifically demonstrate our method using bacteria that express fluorescent or bioluminescent genetic reporters like green fluorescent protein (GFP), luciferase (lux operon), or cellular stains to enable time-lapse optical imaging. We further demonstrate the ability of our method to track competing swarming species in the same experiment.

Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.

Preparazione, Imaging, e la quantificazione di Surface batterica motilità Assays

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

Investigare la motilità guidata dalla Flagella in Escherichia coli applicando tre tecniche consolidate in una serie

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video

Controllo delle velocità di flusso dei fluidi attivi 3D basati su microtubuli utilizzando la temperatura

Un dispositivo a microfluidi per quantificare chemiotassi batterica in gradienti di concentrazione stabile

Quantificazione della motilità dello sciame di superficie batterica su piastre gradienti induttori

Visualizzazione di Spasmi motilità e caratterizzazione del ruolo del

Ricostituzione della motilità a base di actina con proteine disponibili in commercio

Batteri della stampa 3D per studiare la motilità e la crescita in complessi supporti porosi 3D

Batteri della stampa 3D per studiare la motilità e la crescita in complessi supporti porosi 3D

Batteri della stampa 3D per studiare la motilità e la crescita in complessi supporti porosi 3D

Generazione di mutanti nulli per chiarire il ruolo delle glicosiltransferasi batteriche nella motilità batterica

Preparazione, Imaging, e la quantificazione di Surface batterica motilità Assays