L'epitelio mucociliario linee organi interni del nostro corpo e fornisce la prima linea di difesa cancellando particelle estranee. Questo protocollo consente di generare organoide epiteliale mucociliario derivato da cellule embrionali in 24 ore. Il vantaggio principale del nostro metodo è che possiamo monitorare la progressione dal vivo delle transizioni cellulari sulla superficie degli organoidi.
Questo protocollo riproducibile, scalabile e rapido per l'organoide in via di sviluppo consentirà ai ricercatori di affrontare questioni fondamentali per la biologia dell'epitelio mucociliario. Per iniziare, ottenere embrioni X.Laevis raccogliendo manualmente le uova dalle rane femminili stimolate ed eseguendo la fecondazione in vitro. Svalutare gli embrioni fecondati con delicata agitazione nel 2%cisteina, in una terza soluzione salina di Barth modificata da X per circa cinque minuti.
Coltura gli embrioni in un terzo XMBS alla temperatura preferita fino a quando non vengono rilevati i primi segni dello stadio 10, come la comparsa di cellule pigmentate scure intorno al blastopore alla vista vegetale. Seleziona e raccogli embrioni mentre raggiungono la fase iniziale 10 usando gli strumenti per capelli sotto uno stereoscopio. Trasferire gli embrioni selezionati in una piastra di Petri riempita di DFA con una pipetta di trasferimento usa e getta.
Quindi rimuovere la membrana vitellina degli embrioni usando forcep affilate dal lato vegetale, senza interrompere il lato animale dell'embrione. Per isolare il cappuccio animale, posizionare il lato animale dell'embrione verso l'alto. Stima visivamente l'estensione del cappuccio animale da asportare e fai la prima incisione lungo il bordo con un coltello per capelli, tirando il coltello verso l'esterno per fare il taglio.
Ripeti questo processo per creare una catena di piccoli tagli per asportare il tappo animale. Tagliare il bordo a strati spessi del cappuccio animale usando un coltello per capelli per prevenire l'inclusione di precursori del mesoderma. Per separare le cellule ectodermi profonde dal tappo animale, trasferire i tappi degli animali asportati in una piastra di Petri piena di DFA senza calcio e magnesio con una pipetta di trasferimento usa e getta.
Posizionare i tappi degli animali per affrontare il lato animale verso l'alto, mantenendo una distanza generosa da altre espianto. Attendere da cinque a dieci minuti, quindi monitorare le espianto sotto uno stereoscopio. Una volta che le cellule profonde allentate sono state rilasciate dal bordo dello strato superficiale pigmentato scuro, inizia a sollevare lo strato superficiale lontano dalle cellule ectodermi profonde di colore chiaro.
Staccare con cura lo strato superficiale con un coltello per capelli, a partire dal bordo. Quindi raccogliere le cellule ectodermi profonde con il meno DFA privo di calcio e magnesio possibile. Trasferire le cellule ectodermi profonde raccolte in tubi PCR non adesivi contenenti 200 microlitri di DFA e pipettare delicatamente il supporto da due a tre volte per disperdere le cellule trasferite.
Chiudere i tubi e tenerli in posizione verticale per indurre l'aggregazione spontanea sul fondo. Monitorare il processo di aggregazione al microscopio stereo. Le cellule in genere si raccolgono nella parte inferiore del tubo PCR entro un'ora e si assemblano in aggregati sferici entro due o tre ore a seconda delle dimensioni.
Per condurre test di imaging vivo o farmaci durante lo sviluppo degli organoidi epiteliali mucociliari, raccogliere aggregati a due ore dopo l'aggregazione utilizzando una pipetta da 200 microliter dotata di punte allargate. Per consentire agli aggregati di svilupparsi in organoidi epiteliali mucociliari in coltura, raccoglierli dal tubo PCR a cinque ore dopo l'aggregazione e trasferirli in una piastra di Petri riempita di DFA. Posizionare gli aggregati molto distanti l'uno dall'altro per evitare il fusing.
Entro 24 ore dalla coltura a temperatura ambiente, senza alcun fattori aggiunti, si possono osservare organoidi epiteliali mucociliari maturi che ruotano a causa delle ciglia che battono che copre la superficie dell'epitelio differenziato. Preparare una camera di imaging con fondo di vetro incollando un vetro di copertura a una camera acrilica fresata personalizzata con grasso di silicio, sigillando saldamente la camera per evitare perdite dei mezzi di coltura, quindi riempire la camera di imaging con DFA. Preleva una microscopia elettronica a trasmissione esagonale o una griglia TEM usando le forcep e applica una piccola quantità di grasso sul bordo della griglia.
Premere leggermente verso il basso per fissare la griglia TEM sul fondo della camera di imaging. Trasferire gli aggregati nella camera di imaging e posizionarli all'interno della griglia. Riempire la camera con DFA e sigillarla con un vetro di copertura e grasso.
Per seguire la progressione della formazione organoide epiteliale mucociliaria, raccogliere immagini z-stack time-lapsed di aggregati usando un microscopio confocale. Gli organoidi epiteliali mucociliari sono stati generati da progenitori multipotenti degli embrioni X.Laevis dello stadio di gastrula precoce. Gli organoidi hanno un'epidermide matura che è indistinguibile da quella di un girino che include un epitelio completamente differenziato, muco che secestra cellule di calice, cellule multiciliate e piccole cellule secretorie.
La dinamica dello sviluppo organoide è stata seguita dall'imaging dal vivo. Per esaminare l'epitelializzazione che emerge nella fase iniziale della formazione organoide, gli embrioni sono stati etichettati con proteine di giunzione stretta taggate fluorescentmente e proteine localizzanti della membrana. Con la doppia etichettatura i passaggi sequenziali della formazione positiva di giunzione stretta ZO-1 possono essere marcati e analizzati quantitativamente durante l'epitelializzazione.
Alcune regioni di adesione cellula-cellula hanno puncta sparsi di ZO-1 in diversi stadi di epitelializzazione. Al contrario, altre aree hanno un'espressione ZO-1 contigua completamente assemblata. Nel corso del tempo la puncta si coalizza e si collega per formare giunzioni strette contigue, che mantengono la loro morfologia anche durante la divisione cellulare.
Man mano che le giunzioni strette maturano, le cellule si muovono dinamicamente all'interno e all'uscita dalla superficie lungo i piani apicali degli organoidi. L'analisi su più scale è possibile monitorando le cellule in modo spazio-temporale sulla superficie degli organoidi differenzianti. Quando tenti questo protocollo, ricorda di mettere il lato pigmentato scuro del cappuccio dell'animale isolato rivolto verso l'alto e monitoralo sotto uno stereoscopio.
È fondamentale separare lo strato superficiale del cappuccio animale al giusto tempismo nei mezzi DFA senza calcio / magnesio. Questo semplice protocollo offre modi pratici per studiare i comportamenti dinamici delle cellule così come i meccanismi molecolari e fisici che regolano l'epitelio mucociliario.
