Il prelievo ripetuto di sangue dal piccolo animale da laboratorio è un aspetto importante dell'ottimizzazione del piombo farmaceutico. Questo protocollo descrive in dettaglio le abilità microchirurgiche per stabilire un modello permanente di ratto di cannulazione della vena giugulare. Questa tecnica può stabilire in modo efficiente un modello di ratto di cannulazione della vena giugulare e raccogliere ripetutamente campioni di sangue attraverso la cannula nei ratti coscienti evitando stress e dolore.
È importante individuare la vena giugulare e la sua cannulazione poiché la dimostrazione visiva della complessità anatomica non è disponibile per questo modello. Per iniziare, preparare la postazione asettica con il 75% di alcol medico, quindi anestetizzare il ratto rasato con isoflurano mescolato con ossigeno. Iniettare per via sottocutanea la soluzione di meloxicam alla dose di due milligrammi per chilogrammo, quindi sollevare con attenzione la pelle vicino alla clavicola sul lato destro della linea mediana del collo con una pinza e, utilizzando un paio di forbici chirurgiche, praticare un'incisione lunga da 1,5 a 2 centimetri verso il torace.
Per esporre la vena giugulare sottostante, utilizzare le forbici dell'iride per smussare la sottile copertura del tessuto. L'estremità cefalica prossimale della vena giugulare esterna è costituita da due rami che possono essere identificati visivamente. Sollevare la vena giugulare insieme al suo tessuto connettivo membranare per visualizzare la ghiandola linfatica attaccata alla vena giugulare.
Separare con cura la vena lungo la direzione vascolare dal muscolo circostante, dal grasso e da altri tessuti. Spingere la pinza sotto la vena giugulare senza danneggiare i vasi sanguigni collaterali e passare due pezzi di sutura 6-0 sotto la vena per segnare le due estremità del vaso sanguigno individualmente. Tirare un pezzo della sutura il più lontano possibile verso la testa del ratto e ligatare la vena cranicamente con due o tre nodi usando una pinza.
Posizionare la seconda legatura sull'estremità caudale della vena con un nodo sciolto. Attaccare un catetere in poliuretano di 11 centimetri, o PU, alla siringa a punta smussata preparata riempita con la soluzione salina eparinizzata e spingere lentamente la soluzione salina eparinizzata nel catetere per evitare bolle d'aria. Spingere il lato piatto senza punta della pinza sotto la vena giugulare per uscire dall'altro lato.
Fai un piccolo taglio a forma di V sulla vena vicino alla cravatta cranica con un paio di microscissori castroviejo e apri delicatamente l'incisione con la punta della pinza del dilatatore del vaso del gomito. Ritagliare l'apertura obliqua dell'estremità anteriore del catetere della vena giugulare. Piantare l'estremità obliqua del tubo con una pinza e farla scivolare nella vena giugulare.
Mentre si avanza il catetere, prelevare lentamente la pinza microchirurgica del gomito e bloccare la superficie esterna della nave con una pinza. Smettere di inserire il catetere dopo aver colpito il primo segno blu del tubo PU, che è lungo circa tre centimetri. Fissare il catetere inserito alla vena con legature caudali e rostrali usando una pinza.
Infilare una sutura 6-0 attraverso il tessuto esposto sul lato destro dell'incisione usando un ago di sutura e legare la legatura con un emostatico. Quindi piegare il catetere al secondo segno blu per legare con la stessa legatura ed evitare di occludere il tubo in PU. Dopo aver tagliato tutto il filo di sutura extra, chiudere il catetere sostituendo la siringa con punta smussata con un tappo in acciaio inossidabile calibro 22.
Posizionare il ratto in posizione dorsale e pulire delicatamente l'area tra la scapola con il batuffolo di cotone imbevuto di alcol medico al 75%. Usando le forbici chirurgiche, fare un'incisione molto piccola al centro del collo dorsale. Attraverso l'incisione dorsale, guidare e spingere delicatamente il trochar sotto la pelle verso l'incisione ventrale sul lato destro del collo.
Mettere il catetere venoso nel trochar e poi estrarre e guidare il catetere venoso verso l'incisione dorsale. Dopo aver fissato il catetere esteriore nello strato muscolare, chiudere lo strato cutaneo delle incisioni ventrali e dorsali con la sutura in nylon 6-0 e l'ago di sutura e tamponare tutte le incisioni chirurgiche con iodoforo. Quindi, rimuovere il tappo del catetere stringendo il catetere con la punta delle dita.
Posizionare una nuova siringa a punta smussata e tirare lentamente indietro la siringa per testare il flusso sanguigno. Tenere nuovamente il catetere con la punta delle dita. Iniettare 0,2 millilitri di soluzione salina eparinizzata e 0,1 millilitri di soluzione di blocco nel catetere utilizzando la siringa a punta smussata, quindi sostituire la siringa con un tappo in acciaio inossidabile.
Sganciare il catetere e spingere leggermente la spina per garantire la tenuta del catetere. Per raccogliere campioni di sangue per i test ematologici, posizionare il ratto in un dispositivo di ritenuta, aprire il tappo e inserire la siringa nel catetere PU venoso per assicurarsi che il catetere non sia ostruito. Scartare il sangue inizialmente prelevato contenente una miscela di sangue, soluzione salina eparinizzata e soluzione di blocco del catetere.
Utilizzando una nuova siringa, raccogliere 150 microlitri di campione di sangue fresco e trasferire il campione di sangue in un tubo da 0,5 millilitri precedentemente spruzzato con K2EDTA. Iniettare 150 microlitri di soluzione salina normale preriscaldata e infondere 0,2 millilitri di soluzione salina normale eparinizzata sterile attraverso il catetere. Iniettare 100 microlitri della soluzione di blocco nel catetere per garantire la sigillatura e la sterilità del catetere prima della successiva raccolta del campione.
Nel presente studio, sono state studiate le condizioni fisiologiche ed ematologiche nell'arco di sei giorni postoperatorio. La maggior parte dei ratti si è ripresa entro quattro-sei giorni dopo l'intervento chirurgico, come evidenziato dall'aumento di peso corporeo di oltre 10 grammi, dall'assunzione regolare di cibo, da componenti del sangue selezionati relativi a infezioni, disidratazione e infiammazione, inclusi globuli bianchi, globuli rossi, emoglobina e conta piastrinica. Pertanto, i ratti hanno richiesto un minimo di quattro-sei giorni per il recupero dopo la procedura.
La grande assunzione di acqua indicava disidratazione il primo giorno dopo l'operazione. Inoltre, la farmacocinetica dell'acido polifenolo ellagico naturale è stata studiata nel modello di ratto di cannulazione della vena giugulare stabilita e la scarsa biodisponibilità dell'acido ellagico è stata indicata dalla sua bassa concentrazione plasmatica nell'arco di 24 ore. Il corretto isolamento della vena giugulare è il primo passo più importante perché la vena giugulare incorporata all'interno di altri tessuti molli potrebbe non essere immediatamente visibile al ricercatore.
Il prelievo sequenziale di sangue all'interno dello stesso animale può essere eseguito nel modello di ratto JVC stabilito. È uno strumento utile e robusto per valutare le prestazioni delle formulazioni di farmaci in vivo.
