Questo protocollo può essere utilizzato per semplificare l'isolamento e l'identificazione dei nematodi Caenorhabditis dalla natura e registrare importanti dati ecologici e ambientali associati all'ambiente naturale dei nematodi. I principali vantaggi di questa tecnica sono la sua scalabilità e precisione, che sono rese possibili sfruttando piattaforme mobili di raccolta dati, database basati su cloud e funzioni di elaborazione dati standardizzate. Per iniziare, identificare una posizione per esaminare i nematodi caenorhabditis.
Per creare un progetto Fulcrum, crea un account con Fulcrum online utilizzando un accordo educativo gratuito e aggiungi l'applicazione di campionamento sul campo dei nematodi. Quindi aggiungere l'applicazione di isolamento dei nematodi. Stampa una serie di etichette con codice QR come C-Labels per tenere traccia delle collezioni e S-Labels per tracciare gli isolamenti dei nematodi.
Attaccare le etichette C ai sacchetti di plastica Ziploc per l'imballaggio. Conservare il set di S-Label per l'uso in laboratorio. Seleziona il campionamento del campo nematode dal menu a discesa dell'app mobile Fulcrum e premi più per avviare un nuovo record nel progetto.
Scatta una foto del substrato. Tocca il campo C-Label e scegli scansione. Scansiona il codice a barre sul sacchetto di raccolta utilizzando la fotocamera del dispositivo mobile, quindi tocca Fine.
Toccare il campo del substrato e selezionare un tipo di substrato. Misurare la temperatura superficiale del substrato utilizzando il termometro senza contatto e registrare il valore nel campo della temperatura del substrato. Misurare e registrare anche la temperatura e l'umidità ambiente.
Salva e registra in Fulcrum toccando Salva in alto a sinistra dello schermo. Raccogli un cucchiaio del substrato senza bastoncini o altri pezzi duri invertendo il sacchetto di raccolta come un guanto per raccogliere il substrato, quindi sigilla il sacchetto. Per ogni borsa Ziploc, annotare la C-Label sulla borsa e attaccare una C-Label corrispondente al coperchio di una piastra da 10 centimetri macchiata di batteri OP50.
Trasferire un cucchiaio di campione da ogni sacchetto di raccolta alle piastre C usando un cucchiaio di plastica pulito. Nell'applicazione Fulcrum, scegliere isolamento nematodi dal menu dell'applicazione. Quindi crea un nuovo record di isolamento toccando l'icona più in basso a destra.
Tocca il pulsante di selezione per trovare l'etichetta C associata a un campione. Tocca l'icona di ricerca. Quindi toccare l'icona di scansione per eseguire la scansione del codice QR C-Label.
Cerca i nematodi sulla piastra C con un microscopio di dissezione. Toccare i vermi sul campo campione per registrare la presenza di nematodi sul campione. Se non sono presenti nematodi, parafilmare la piastra C e smaltirla in un bidone a rischio biologico.
Se sono presenti nematodi, isolare fino a cinque nematodi dalla piastra C e trasferire ciascuno alla propria piastra S. Quindi, toccare il campo piastre con etichetta S per inserire la piastra S utilizzata per questo isolamento. Tocca il più in basso a destra.
Tocca S-Label e quindi fai clic su scansione per aprire la fotocamera del dispositivo, quindi scansiona il codice QR S-Label sulla piastra S. Tocca il pulsante salva in alto a destra una volta che il record di isolamento ha aggiunto correttamente tutte le informazioni, quindi parafilma le piastre S con nematodi isolati e mettile da parte in un'area designata per contenere piastre S con nematodi. Accedi al sito web di Fulcrum e seleziona l'applicazione per l'isolamento dei nematodi.
Fare clic su exporter per scaricare un file zip che contiene l'isolamento del nematode s_labeled_plates. csv. Passa al modello di genotipizzazione isolato selvaggio Foglio Google e copia il Foglio Google.
Posizionare le S-Label copiate dall'isolamento del nematode s_labeled_plates. csv nel foglio di genotipizzazione. Verificare la presenza di animali proliferanti su piastre S 48 ore dopo l'isolamento.
Se una piastra S ha animali proliferanti, inseriscine una nella colonna di proliferazione 48 nel foglio di genotipizzazione, quindi sposta la piastra S in una scatola etichettata 48 ore di proliferazione scatola uno. Controllare le piastre S che non proliferavano a 48 ore dopo l'isolamento di nuovo a 168 ore dopo l'isolamento. Se una piastra S sta proliferando, inseriscine una nella colonna di proliferazione 168 sul foglio di genotipizzazione e quindi sposta la piastra S in una scatola etichettata 168 ore di proliferazione box one.
Filtra il genotipo in Foglio Google per includere solo le S-Labels in una casella di proliferazione da lisare, quindi seleziona le colonne S-Label attraverso i nodi di lisi. Stampare un foglio di lavoro di lisi per ogni scatola di proliferazione da lisare. Preparare 12 tubi di striscia di pozzetto per i campioni da lisare.
Scomporre un tubo di striscia e aggiungere otto microlitri di tampone di lisi a ciascun tappo con un pipetter ripetuto. Scegli da tre a cinque animali dalle piastre di origine nelle posizioni del cappuccio indicate sul foglio di lavoro della lisi. Ripetere per un massimo di otto tubi di striscia e posizionare i tubi di striscia nel congelatore a meno 80 gradi Celsius.
Rimuovere i set di tubi a strisce ed eseguire il programma di lisi nel termociclatore. Quindi conservare i lisati a meno 80 gradi Celsius per un massimo di una settimana. Rimuovere i tubi della striscia dal congelatore a meno 80 gradi Celsius e scongelare il materiale di lisi sul ghiaccio.
Mentre il materiale di lisi si sta scongelando, preparare le miscele master ITS2 e SSU in tubi separati su ghiaccio. Aggiungere due microlitri di lisato al pozzo appropriato nella piastra PCR con una pipetta multicanale a basso volume. Eseguire le PCR con il programma di termociclatori appropriato e registrare quali S-Label producono prodotti ITS2 o SSU PCR nel foglio di genotipizzazione.
Per ogni campione positivo all'ITS2, utilizzare il restante prodotto ITS2 PCR per il sequenziamento Sanger e ottenere i file di output seq per ogni S-Label dalla piattaforma di sequenziamento. Passare al sito Web NBCI BLAST in un browser Web per iniziare la ricerca BLAST. Per le sequenze di piastre S che BLAST a una specie di Caenorhabditis, inserisci il genere completo e il nome della specie del BLAST superiore colpito nella colonna ID specie.
Assegnare un nome ai ceppi con nomi univoci, seguendo le convenzioni di nomenclatura caenorhabditis e immettere i nomi dei ceppi nella colonna del nome del ceppo. Per elaborare i dati, accedere al sito Web Fulcrum ed esportare i dati grezzi del progetto dal database Fulcrum. Aprire un nuovo script R e seguire le istruzioni nella vignetta easyfulcrum per elaborare i dati di raccolta.
In NBCI BLAST, i risultati di S-Label S-05554 mostrano che il primo successo è Caenorhabditis briggsae. Inoltre, alcuni nematodi isolati richiedono uno sforzo aggiuntivo per il genotipo. Ad esempio, circa il 2% degli isolati non riesce ad amplificare con il set di primer SSU PCR dopo il primo tentativo di lisi e deve essere fatto affidamento per garantire che il materiale di lisi sia adatto per l'amplificazione con il set di primer ITS2.
Seguendo questa procedura, i ricercatori possono esplorare i dati ecologici e ambientali associati agli isolati di nematodi selvatici per identificare le posizioni e le caratteristiche del substrato che hanno maggiori probabilità di ospitare specifiche specie di nematodi.
